Lấy 1g cao tiến hành theo mục 2.3.4.3, 2.3.4.4, 2.3.4.5. Kết quả thu được ở Bảng 3.14:
Bảng 3.14. Kết quả cắn, tro toàn phần và pH của cao đặc
Mẫu nghiên cứu Số lần (n) Cắn (%) Tro toàn phần (%) pH
Cao đặc 3 14,67 8,29 4,03
Nhận xét: Từ kết quả nghiên cứu có thể đưa ra chỉ tiêu về cắn là không quá 20 %,
tro toàn phần không quá 10 %, pH nằm trong khoảng 3,5 – 4,5. 3.5.4. Giới hạn nhiễm khuẩn
- Tiến hành theo mục 2.3.4.6.
- Đếm số lượng vi khuẩn hiếu khí và vi nấm: Kết quả thu được trình bày ở Bảng
3.15:
Bảng 3.15. Kết quả giới hạn nhiễm khuẩn của cao đặc
Vi khuẩn hiếu khí Vi nấm Công thức tính số lượng vi sinh vật Độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3
Max (N × d)
N: Số khuẩn lạc trong mỗi đĩa
d : độ pha loãng (Ưu tiên lựa chọn
các đĩa có 30-300 khuẩn lạc)
Đĩa 1 16 18 10 1 1 0
Đĩa 2 5 11 0 5 1 1
Thời gian bắt đầu
ủ 07/05/2013 07/05/2013
Thời gian đọc kết
quả 08/05/2013 11/05/2013
Kết quả 100 – 5000 5 - 100
Nhận xét: số vi khuẩn hiếu khí trong khoảng 100 – 5000 cfu/g.
Số vi nấm nằm trong khoảng từ 5 – 100 cfu/g. - Tìm vi khuẩn gây bệnh:
Kết quả: môi trường lỏng nuôi cấy không bị đục.
3.5.5. Giới hạn kim loại nặng
Lấy 1g cao tiến hành theo mục theo mục 2.3.4.7.
Kết quả: Ống chuẩn có màu nâu nhạt khi so sánh với ống trắng Ống thử có màu nâu nhạt hơn so với ống chuẩn.
Nhận xét: Hàm lượng kim loại nặng trong Cao đặc không quá 20 ppm.
3.5.6. Xác định giới hạn aconitin trong cao
Lấy 10g cao đặc, thêm 2ml ammoniac, sau đó tiến hành theo mục 2.3.2.3. Kết quả thu được ở Hình 3.5. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét: trên sắc kí đồ của cao đặc sau khi phun thuốc thử Dragendoff không có
vết màu da cam trùng với vết màu da cam của aconitin
3.6. Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc Kỳ Phụ
(1). Tính chất: Khối mềm dẻo, màu nâu đen, đồng nhất, vị hơi chua. (2). Mất khối lượng do làm khô: Không quá 20 %.
(3). Cắn: lượng cắn không quá 20 % (4). Tro toàn phần: không quá 10 %
(5). pH: dung dịch 1 % (kl/tt) trong nước phải có pH từ 3,5 – 4,5. (6). Định tính:
- Trên sắc kí đồ của alcaloid phải cho 2 vết màu cam, 1 vết có Rf trùng với 1 vết của Phụ tử khi chuẩn bị trong cùng điều kiện, không có vết của aconitin.
- Trên sắc kí đồ của flavonoid phải có 5 vết có màu sắc và Rf trùng với 5 vết của Hoàng kỳ khi chuẩn bị trong cùng điều kiện.
- Phổ hấp thụ tử ngoại của alcaloid trong cao đặc có 2 cực đại hấp thụ ở bước sóng 231 ± 1 nm và 274 ± 1 nm.
- Phổ hấp thụ tử ngoại của saponin trong cao đặc có 1 cực đại hấp thụ ở bước sóng 205 ± 1 nm.
(7). Định lượng:
- Cao đặc phải chứa ít nhất 0,05 % alcaloid toàn phần tính theo aconitin (C34H47NO11) trên cao khô kiệt xác định theo phương pháp acid - base.
- Cao đặc phải chứa ít nhất 0,5% flavonoid toàn phần theo phương pháp đo quang.
(8). Giới hạn aconitin: không được có. (9). Giới hạn nhiễm khuẩn:
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 10000 cfu/g. - Tổng số nấm và mốc: không quá 100 cfu/g.
- Mẫu chế phẩm không được có Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphyllococcus areus.
(10). Giới hạn kim loại nặng: không quá 20 ppm.
3.7. Bàn luận
3.7.1. Về nguyên liệu đầu vào
- Để đảm bảo tính khoa học xuyên suốt quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành khảo sát dược liệu đầu vào theo tiêu chuẩn DĐVN IV.
- Về Hoàng kỳ, hiện nay trên thị trường xuất hiện 2 loại dược liệu Hoàng kỳ nhưng một số thành phần khác nhau, tuy nhiên với phạm vi của khóa luận, chọn loại dược liệu Hoàng kỳ phổ biến trên thị trường làm loại dược liệu nghiên cứu bào chế, xây dựng tiêu chuẩn cao. Về dược liệu Hoàng kỳ được chọn làm nghiên cứu có đầy đủ các đặc điểm về hình thái, bột, vi phẫu theo tiêu chuẩn DĐVN IV, tuy nhiên định tính bằng sắc kí lớp mỏng chưa phát hiện thấy Astragalosid - IV. Kết quả được trình bày ở phụ lục.
3.7.2. Về bào chế cao đặc
- Các alcaloid độc nhóm diester bị thủy phân trong môi trường nước, khi nấu với cao nước ở nhiệt độ cao thì tốc độ thủy phân càng nhanh. Do vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp bào chế cao là phương pháp sắc. Kỹ thuật sắc cho hiệu suất cao (40,51 %), quy trình đơn giản, thời gian bào chế ngắn, phù hợp với tình hình nghiên cứu ở nước ta cũng như thích hợp khi tiến hành trên quy mô sản xuất lớn.
- Tuy nhiên, theo tài liệu đã nghiên cứu thì MeOH và EtOH chiết được nhiều Astragalosid - IV từ Radix Astragali. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu chúng tôi cũng làm thêm mẫu cao đặc bài thuốc trong đó Phụ tử được bào chế với nước, kết
hợp với Hoàng kỳ bào chế với EtOH 700, sau đó cô dung dịch thu được tới độ đậm đặc nhất định rồi phối hợp lại.
3.7.3. Về kết quả định tính - Định tính alcaloid:
Kết quả định tính về phản ứng hóa học cho thấy Phụ tử và cao đặc cho phản ứng dương tính với thuốc thử chung của alcaloid.
Sắc kí đồ của cao đặc cho 2 vết màu cam, trong đó có 1 vết có Rf trùng với vết màu cam của Phụ tử, không có vết trùng với vết màu cam của aconitin. Phổ hấp thụ của alcaloid được nghiên cứu theo phương pháp của CP (2005) [33]. Phổ tử ngoại của alcaloid trong Phụ tử có cực đại hấp thụ ở bước sóng 231 nm. Trong khi đó phổ tử ngoại của alcaloid cao đặc có hấp thụ cực đại ở 2 bước sóng 231 nm và 274 nm. Hai kết quả này chứng tỏ trong quá trình chế biến có sự biến đổi alcaloid. Kết quả này cũng phù hợp với tiêu chuẩn của CP (2005) [33].
Như vậy để định tính alcaloid trong cao đặc có thể dùng 3 phương pháp:
+ Phản ứng hóa học với các thuốc thử chung của alcaloid: TT Mayer, TT Bouchardart, TT Dragendoff. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Sắc kí lớp mỏng: sắc kí đồ của cao đặc cho 2 vết màu da cam, có 1 vết có Rf trùng với vết của Phụ tử, không có vết trùng với aconitin
+ Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại: alcaloid trong cao đặc cho 2 cực đại hấp thụ ở bước sóng 231 nm và 274 nm, so sánh với Phụ tử cho 1 cực đại hấp thụ ở bước sóng 231 nm.
- Định tính saponin:
Kết quả phản ứng hóa học cho thấy Hoàng kỳ và cao đặc cho phản ứng dương tính rõ. Phổ hấp thụ tử ngoại của saponin trong Hoàng kỳ và cao đặc đều cho cực đại hấp thụ ở bước sóng 205 nm. Kết quả này cũng giống với nghiên cứu trước đó [23]. - Định tính flavonoid:
Phương pháp định tính flavonoid được tiến hành theo phương pháp của CP (2010) [32]. Sắc kí đồ của flavonoid trong cao đặc có 5 vết, sắc kí đồ của Hoàng kỳ có 7
vết trong đó 5 vết của cao đặc đều có Rf trùng với 5 vết của Hoàng kỳ. Điều này chứng tỏ trong quá trình bào chế cao một vài flavonoid đã bị thay đổi.
3.7.4. Về kết quả định lượng - Định lượng alcaloid toàn phần:
Alcaloid là hoạt chất chính trong Phụ tử, vì vậy trong các chế phẩm bào chế từ Phụ tử cũng phải có quy định hàm lượng alcaloid. Chuyên luận Xuyên Ô chế, Thảo Ô chế trong CP (2005) [33] quy định: Hàm lượng alcaloid toàn phần không được thấp hơn 0,2 %. Kết quả nghiên cứu cho thấy:
+ Hàm lượng alcaloid toàn phần trong cao đặc giảm nhiều so với Phụ tử. Chứng tỏ trong quá trình chế biến và bào chế đã có tác dụng làm giảm alcaloid toàn phần do thủy phân phần lớn alcaloid diester và aconitin. Trong cao đặc không phát hiện thấy aconitin chứng tỏ aconitin đã bị thủy phân hoàn toàn trong quá trình bào chế cao. + Hàm lượng alcaloid toàn phần định lượng được là 0,247 % tính theo dược liệu khô tuyệt đối, kết quả này cũng phù hợp với tiêu chuẩn của CP (2005).
- Định lượng flavonoid toàn phần
Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo phương pháp cân là 1,744 %, theo phương pháp đo độ hấp thụ, phương pháp đường chuẩn là 0.635 %. Như vậy nếu tính theo phương pháp cân thì hàm lượng flavonoid toàn phần gấp 3 lần phương pháp đo độ hấp thụ. Theo tôi, cần nghiên cứu thêm, tiến hành theo hai phương pháp với số mẫu lớn hơn, chọn một phương pháp có độ tin cậy cao để xây dựng tiêu chuẩn cho chỉ tiêu định lượng flavonoid toàn phần này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Sau khi hoàn thành đề tài, chúng tôi đã đạt được những mục tiêu đã đề ra:
* Bào chế được cao đặc Kì phụ vương bằng phương pháp sắc với hiệu suất bào chế cao, đạt 40,51% 1,87 trên tổng 488,88 g dược liệu.
* Xây dựng được phương pháp định tính và định lượng các hoạt chất trong cao đặc Trong đó áp dụng các phương pháp định tính thu được các kết quả sau:
- Định tính alcaloid: Sắc kí đồ của Cao đặc có 2 vết màu da cam khi phun TT Dragendoff, có 1 vết có Rf trùng với Rf của Phụ tử khi chuẩn bị trong cùng điều kiện.
- Phổ hấp thụ tử ngoại của cao đặc có 2 cực đại hấp thụ ở bước sóng 231 nm và 274 nm, phổ tử ngoại của Phụ tử có 1 cực đại hấp thụ ở bước sóng 231 nm khi chuẩn bị trong cùng điều kiện.
- Định tính flavonoid: Sắc kí đồ của Cao đặc có 5 vết trùng có Rf trùng với Rf của Hoàng kỳ khi chuẩn bị trong cùng điều kiện.
- Định tính saponin: Phổ hấp thụ tử ngoại của Cao đặc và Hoàng kỳ đều có cực đại hấp thụ ở bước sóng 205 nm khi chuẩn bị trong cùng điều kiện.
Áp dụng các phương pháp định lượng thu được các kết quả sau:
- Hàm lượng alcaloid toàn phần trong cao đặc là 0,247 % ± 0,006 trên dược liệu khô tuyệt đối và 0,087 % ± 0,002 trên cao khô tuyệt đối.
- Hàm lượng saponin toàn phần đạt 1,308 % ± 0,028 trên cao khô tuyệt đối.
- Hàm lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp cân đạt 1,744 % ± 0,058 theo phương pháp đo độ hấp thụ đạt 0.635 % ± 0.114 trên cao khô tuyệt đối..
* Xây dựng được dự thảo tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc Kỳ phụ vương.
KIẾN NGHỊ
- Nghiên cứu bào chế cao với quy mô lớn hơn để ứng dụng trong sản xuất.
- Nghiên cứu bào chế cao với cồn ở các nồng độ khác nhau, chọn nồng độ loại được nhiều tạp, có hàm lượng hoạt chất cao, cho tác dụng tốt nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Đỗ Huy Bích và các cộng sự (2004), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 2, NXB khoa học và kĩ thuật, Hà Nội, tr. 490 - 495. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Đỗ Huy Bích và các cộng sự (2004), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, NXB khoa học và kĩ thuật, Hà Nội, tr. 946 - 950.
3. Bộ môn Dược cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội (2006), Dược học cổ truyền, Nhà xuất bản y học, tr. 148 – 149, 227 – 228.
4. Bộ môn y học cổ truyền – Trường Đại học Y Hà Nội (2002), Bài giảng Y học
cổ truyền, Nhà xuất bản Y học, tr. 332 – 334.
5. Bộ môn y học cổ truyền (2002), Bào chế đông dược, Trường Đại học Y Hà
Nội, Nhà xuất bản Y học, tr. 174 – 176.
6. Bộ môn y học cổ truyền dân tộc – Trường Đại học Y Hà Nội (1994), Y học cổ
truyền, Nhà xuất bản Y học, tr. 253 – 254.
7. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB y học, tr. 782 - 783, 860 – 862. 8. Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học Hà Nội, tr. 84 - 104. 9. Bùi Hồng Cường, Phùng Hòa Bình, Nguyễn Trọng Thông và các cs (2010),
Phụ tử - vị thuốc quý và phương pháp chế biến an toàn hiệu quả, NXB khoa học và
kĩ thuật, tr. 15 - 150.
10. Trần Duy Đông (2002), Góp phần tiêu chuẩn hóa chế phẩm bột Tam Hoàng của bệnh viện Y học cổ truyền Cao Bằng, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, tr. 15-16.
11. Trình Nhu Hải, Lý Gia Canh (2004), Trung Quốc danh phương toàn tập, NXB y học Hà Nội, tr. 282.
12. Nguyễn Thị Hằng (2011), Nghiên cứu phương pháp vân tay sắc kí (HPLC, TLC) góp phần đánh giá chất lượng vị thuốc Hoàng kì, khóa luận tốt nghiệp Dược
sĩ, tr. 22 – 26.
13. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 1, Nhà xuất bản trẻ, tr. 325, 976. 14. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (2004), Bài giảng Dược liệu, tập 2, tr. 170 – 177.
15. Đỗ Tất Lợi (1999 ), Những cây thuốc và Vị thuốc Việt Nam, NXB y học, tr. 878 - 882, 887 - 889.
16. Vũ Chí Nguyễn (2005), Nghiên cứu một số phương pháp chế biến Phụ tử từ cây
17. Chu Thế Ninh (2005), Tiêu chuẩn hóa phương pháp chế biến vị thuốc phụ tử phiến và cao phụ tử từ cây Ô đầu trồng ở Sa Pa (Lào Cai), Luận văn thạc sĩ Dược
học, tr. 31 – 45.
18. Phạm Xuân Sinh (1999), Phương pháp chế biến thuốc cổ truyền, NXB Y học, tr. 219 – 222.
19. Hoàng Duy Tân, Trần Văn Nhử (1995), Tuyển tập phương thang đông y, NXB Đồng Nai, tr. 634.
20. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi,
NXB khoa học kĩ thuật, tr. 134 – 135, 186 – 187.
21. Nguyễn Viết Thân (2010), Thực tập dược liệu, Trung tâm thư viện Đại học Dược Hà Nội, tr. 35 – 36, 42 – 43, 49 – 50, 62, 70 – 71, 75.
22. Thái Duy Thìn (2005), Nghiên cứu ứng dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
và đo quang phổ UV – VIS để định tính và định lượng các hoạt chất trong một số thuốc có từ 2 – 5 thành phần, đề tài nghiên cứu cấp bộ, tr. 7–12.
23. Lê Hữu Trác, Hải Thượng y tông tâm lĩnh, NXB y học, tr, 493.
24. Phạm Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng
sinh học của bài thuốc kì phụ vương, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hà Nội - 2012, tr. 12.
25. Viện dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 392 – 397, 451 – 454.
Tiếng anh
26. Ameri A. (1998), "The effects of Aconitum alcaloids on the central nervous system", Prog. Neurobiol., 56(2), p. 211 – 235.
27. Beyer J., Claf H. Drummer, Hans H. Maurer (2009), “Analysis of toxic alcaloid in body”, Forensic science International,185, p. 1–9.
28. Huang X., Liu Y., Liu Z., Liu S. (2009), “Studies on principal components and antioxidant activity of different Radix Astragali samples using high - performance liquid chromatography electrospray ionization multiple-stage tandem mass spectrometry”, Elsevier, 78, p. 1090 – 1101.
29. Jing L., Ch. Hu – biao (2011), “Review of Astragali Radix”, Chinese Herbal
Medicines, 3(2), p. 90 – 105.
30. Qi L - W., Yu Q-T., (2006), “Quality evaluation of Radix Astragali through a simultaneous determination of six major active isoflavonoids and four main
saponins by high-performance liquid chromatography coupled with diode array and evaporative light scattering detectors”, Chromatography A, (1134), p. 162–169. 31. Singhuber J., Zhu M. (2009), “Aconitum in Traditional Chinese Medicine – A valuable drug or an unpredictable risk?”, Ethnopharmacology, 126, p. 18 – 30. 32. The State Phamacopoeia Commission of the People’s Republic of China (2010), Phamacopoeia of the people’s republic of China I, People’s Medical
publishing house, Bejing, China, p. 58 – 60.
33. The State Phamacopoeia Commission of the People’s Republic of China