3.3.3.1. Chuẩn bị cột sắc ký.
- Cột sắc ký có chiều dài 65 cm, đường kính 4 cm được rửa sạch và làm khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng.
- Dung môi rửa giải : hỗn hợp dichloromethan: methanol (95:5).
- Chất nhồi cột: 120g silicagel cỡ hạt 43-60 µm (Merck) được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
- Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt.
- 1.80g cắn ethyl acetat được sử dụng để tiến hành phân lập.
3.3.3.2. Tiến hành chạy sắc ký cột.
- Nhồi cột: Cho một lượng vừa đủ hỗn hợp dung môi rửa giải dichloromethan: methanol (95 : 5) vào silicagel đã hoạt hóa, phân tán đều silicagel trong cốc có mỏ, rồi đổ thành dòng từ từ theo thành cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Rửa thành cột bằng dung
môi rửa giải. Ổn định cột bằng cách vừa mở khóa cột vừa dùng bơm áp lực dồn dung môi xuống cho đến khi silicagel không nén được nữa. Khi lượng dung môi chảy xuống sát bề mặt silicagel, khóa cột và tiến hành đưa cắn lên cột.
- Đưa cắn lên cột: Hòa tan hoàn toàn 1,80g cắn bằng một lượng tối thiểu methanol. Thêm một ít silicagel, trộn đều. Bay hơi hết dung môi, thu được dạng bột tơi mịn. Đưa cắn lên cột sao cho không làm xáo trộn lớp silicagel bề mặt.
- Rửa giải: Sử dụng gradient hỗn hợp dung môi dichoromethan và methanol. Hứng các phân đoạn vào từng ống nghiệm riêng biệt, mỗi phân đoạn khoảng 8 ml, tốc độ 20 giọt/ phút. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng λ = 254 nm, λ = 366 nm và sau khi phun thuốc thử vanilin/H2SO4, gộp các phân đoạn ống có sắc ký đồ giống nhau.
- Kết quả thu được 97 ống trong đó có phân đoạn gồm ống 1 đến 7 (ký hiệu là E1) sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat ( 95 : 5) quan sát thấy trên sắc ký đồ có 2 vết chất chính có giá trị Rf lần lượt là 0,29 và 0,60.
Các ống nghiệm còn lại gồm nhiều vết chất với hàm lượng ít, vì vậy chúng tôi tập trung chủ yếu tách phân đoạn trên.
3.3.3.3 Tinh chế phân đoạn E1
Tinh chế phân đoạn E1 bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel, dung môi rửa giải cột là n – hexan : ethyl acetat (98 : 2). Hứng 2-3 ml/ ống nghiệm. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat ( 95 : 5), qua sát đèn đèn tử ngoại và sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4, những ống nghiệm có sắc kí lớp mỏng giống nhau gộp thành một phân đoạn. Kết quả thu được 2 phân đoạn :
Phân đoạn 1(ký hiệu là E1’): Có một vết chất chính hiện màu tím hồng sau khi phun thuốc thử vanilin/H2SO4 và một vài vết chất phụ khác. Tinh chế lại E1’ bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel, dung môi rửa cột là n – hexan thu được một chất (ký hiệu PR4).
Giá trị Rf của PR4 trong 3 hệ dung môi được thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Giá trị Rf của PR4 trong 3 hệ dung môi khác nhau
Hệ dung môi Tỷ lệ Rf
I: n- hexan: chloroform 7:3 0,21 II: n- hexan: ethyl acetat 95:5 0,41
III: chloroform 100% 0,83
(a) (b) (c)
Hình 3.7 Sắc ký đồ PR4 ở 3 hệ dung môi dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng λ = 254 nm(a), λ = 366nm (b) và sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 (c).
Phân đoạn 2 : Có một vết chất chính không quan sát được dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 254nm, có huỳnh quang màu xanh lam dưới dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 366nm và hiện màu tím hồng sau khi phun thuốc thử vanilin/H2SO4. Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng trong 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, kết quả trên sắc ký đồ cả 3 hệ cho 1 vết chất nhưng lượng chất rất nhỏ chưa đủ để xác định cấu trúc ( ký hiệu PR5).
Giá trị Rf của PR5 trong 3 hệ dung môi được thể hiện trong bảng 3.4
Bảng 3.4 Giá trị Rf của PR5 trong 3 hệ dung môi khác nhau
Hệ dung môi Tỷ lệ Rf
I: n-hexan:Ethyl acetat 95:5 0,22 II: n-hexan :cloroform 5:95 0,40 III: Clorofor: ethyl acetat 19:1 0.76
(a) (b) (c)
Hình 3.8 Sắc ký đồ PR5 với 3 hệ dung môi dưới bước sóng λ = 366nm (a), λ = 254nm (b) và sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 1%(c)