Cân 900g dược liệu đã tán nhỏ, chiết hồi lưu bằng methanol (chiết 2 lần, mỗi lần trong 2 giờ). Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc, cất thu hồi dung môi methanol dưới áp suất giảm thu được cao mềm (ký hiệu Ctp).
Phân tán Ctp vào 250ml nước, chuyển dịch phân tán vào bình gạn, thêm đồng thể tích n – hexan, chiết nhiều lần đến khi lớp n – hexan không còn màu xanh. Gộp dịch chiết n – hexan, loại nước bằng natri sulfat khan, cất thu hồi dưới áp suất giảm, sấy khô thu được cắn n – hexan (Cn-hexan; 23,26g).
Lớp nước còn lại tiếp tục chiết với ethyl acetat, chiết nhiều lần đến khi lớp ethyl acetat phản ứng âm tính với dung dịch amoniac đậm đặc. Gộp dịch chiết ethyl
acetat, loại nước bằng natri sulfat khan, cất thu hồi dưới áp suất giảm thu được cắn ethyl acetat ( ký hiệu CEtOAc; 1,81g).
Quy trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết n – hexan, ethyl acetat được tóm tắt trong sơ đồ hình 3.1.
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất phân đoạn n – hexan, ethyl acetat từ lá cây Lâm vồ. Dược liệu (900g) Dịch chiết MeOH toàn phần Ctp Lớp n – hexan Lớp nước CEtOAc(1,81g)
Lớp ethyl acetat Cn-hexan (23,26g) 1. Chiết hồi lưu, 2h / lần × 2 lần 2. Lọc
Lớp nước
Cất thu hồi dung môi
1.Phân tán vào 250ml nước.
2.Chiết với n – hexan (250ml× 4lần)
Chiết với ethyl acetat (250ml × 8 lần)
Cất thu hồi dung môi
Cất thu hồi dung môi Bã dược liệu
3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết n – hexan và ethyl acetat lá cây Lâm vồ
3.3.1. Định tính phân đoạn dịch chiết n – hexan, ethyl acetat lá cây Lâm vồ bằng sắc ký lớp mỏng.
3.3.1.1 Định tính phân đoạn dịch chiết n – hexan bằng sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị:
Dung dịch chấm sắc ký :
• Cắn n – hexan được hòa tan lại trong n – hexan để chấm sắc ký.
• Chất đối chiếu: β – sitosterol hòa tan trong chloroform (nồng độ 1 mg/ml).
Bản mỏng : bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
Hệ dung môi khai triển: n – hexan : ethyl acetat ( 85 : 15)
- Tiến hành: Sắc ký sau khi khai triển được để ngoài không khí cho bay hơi hết dung môi, quan sát các vết sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng λ = 254 nm, λ = 366 nm và sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4, sấy ở 110oC trong 10 phút.
- Kết quả được thể hiện qua sắc ký đồ hình 3.3 - Nhận xét:
Phân đoạn n – hexan khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm thấy xuất hiện một số vết chất có giá trị Rf nhỏ, dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 366 nm xuất hiện nhiều vết có huỳnh quang màu đỏ có thể là chlorophyll, sau khi phun thuốc thử hiện màu vanilin / H2SO4 thì xuất hiện ít nhất 7 vết chất có màu hồng tím không trùng với vết phát huỳnh quang màu đỏ ở ánh sáng tử ngoại λ = 366nm có giá trị Rf lần lượt là: 0,22; 0,33; 0,37; 0,47; 0,71; 0,78; 0,92.
Chất đối chiếu β – sitosterol không quan sát được dưới ánh sáng tử ngoại nhưng hiện màu hồng tím sau khi phun thuốc thử hiện màu vanilin /H2SO4, có giá trị Rf là 0.22, có cùng màu và giá trị Rf với một vết của phân đoạn n – hexan vì vậy sơ bộ kết luận phân đoạn n – hexan của lá cây Lâm vồ (F. rumphii Blume) có chứa β – sitosterol.
I: Phân đoạn n – hexan
II: Chất đối chiếu β – sitosterol
Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn n – hexan dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng λ = 254 nm (a), λ= 366nm (b) và sau khi phun thuốc thử vanilin/H2SO4 (c). 3.3.1.2. Định tính phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị:
Dung dịch chấm sắc ký: cắn ethyl acetat được hòa tan lại trong ethyl acetat để chấm sắc ký.
Bản mỏng : bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
Hệ dung môi khai triển: toluen : ethyl acetat: acid formic ( 3:1.5:0.5)
- Tiến hành: Sắc ký sau khi khai triển được để ngoài không khí cho bay hơi hết dung môi, quan sát các vết sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng λ = 254 nm, λ = 366 nm và sau khi phun thuốc thử AlCl3 5%/ ethanol quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng λ = 366 nm.
(a) (b) (c)
- Kết quả:
(a) (b) (c)
Hình 3.3 Sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng λ= 254nm (a), λ = 366nm và sau khi phun thuốc thử AlCl3 5%/ ethanol
(quan sát ở bước sóng λ = 366nm).
- Nhận xét: Sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254nm xuất hiện ít nhất 8 vết chất có giá trị Rf là 0,13; 0,21; 0,26; 0,30; 0,39; 0,45; 0,53; 0,76. Dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 366nm xuất hiện ít nhất 4 vết chất phát huỳnh quang màu xanh lam có giá trị Rf nhỏ là 0,20; 0,26; 0,28; 0,36, các vết này có huỳnh quang mạnh hơn sau khi phun thuốc thử AlCl3 5%/ ethanol và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 366nm. Đồng thời sau khi phun thuốc thử, trên sắc ký đồ xuất hiện một vết chất phát huỳnh quang màu xanh dương, có giá trị Rf là 0,54.
3.3.2. Phân lập một số chất trong phân đoạn n – hexan 3.3.2.1. Sắc ký cột lần thứ nhất 3.3.2.1. Sắc ký cột lần thứ nhất
Chuẩn bị cột sắc ký
- Cột sắc ký có chiều dài 65 cm, đường kính 3 cm được rửa sạch và làm khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng.
- Dung môi rửa giải: methanol. - Chất nhồi cột: sephadex LH20.
- 3,1 g cắn n – hexan được sử dụng để tiến hành phân lập. Tiến hành sắc ký cột
- Nhồi cột: Sephadex LH20 đã được ngâm trương nở trong methanol được đổ thành dòng từ từ theo thành cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Rửa cột bằng methanol. Ổn định cột bằng cách để qua đêm. Cho một lớp bông mỏng lên cột sao cho không làm xáo trộn sephadex bề mặt. Mở khóa cột đến khi lớp dung môi chảy xuống sát bề mặt sephadex, khóa cột và tiến hành đưa cắn lên cột.
- Đưa cắn lên cột: Hòa 3,1 g cắn bằng một lượng tối thiểu methanol, lọc qua giấy lọc. dùng pipet đưa dịch lọc lên cột vòng theo thành cột để tránh xáo động lớp sephadex bề mặt và dịch lọc phân bố đều trên bề mặt sephadex.
- Rửa giải: Sử dụng methanol. Hứng các phân đoạn vào từng ống nghiệm riêng biệt, mỗi phân đoạn khoảng 7ml, tốc độ 20 giọt/phút. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat (95 : 5), quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254nm, 366nm và sau khi phun thuốc thử vanilin/H2SO4, gộp các phân đoạn ống có sắc ký đồ giống nhau.
Kết quả thu được một số phân đoạn, trong đó phân đoạn từ ống 6 đến 15 trên sắc ký đồ có 5 vết cho màu hồng tím với thuốc thử vanilin/ H2SO4 ( ký hiệu H1). Các phân đoạn còn lại gồm nhiều vết chất có hàm lượng không cao, trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi tập trung tinh chế phân đoạn H1.
3.3.2.2. Sắc ký cột lần hai
Chuẩn bị cột sắc ký.
- Cột sắc ký có chiều dài 45 cm, đường kính 2 cm được rửa sạch và làm khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng.
- Dung môi rửa giải : hỗn hợp n – hexan : ethyl acetat (98:2).
- Chất nhồi cột: 15g silicagel cỡ hạt 43-60 µm (Merck) được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
- Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt. - Cắn H1 được sử dụng để tiến hành phân lập.
Tiến hành chạy sắc ký cột.
- Nhồi cột: Cho một lượng vừa đủ hỗn hợp dung môi rửa giải n – hexan : ethyl acetat (98 : 2) vào silicagel đã hoạt hóa, phân tán đều silicagel trong cốc có mỏ, rồi đổ thành dòng từ từ theo thành cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Rửa thành cột bằng dung môi rửa giải. Ổn định cột bằng cách vừa mở khóa cột vừa dùng bơm áp lực dồn dung môi xuống cho đến khi silicagel không nén được nữa. Đưa 1 lớp cát sạch (đã được rửa nhiều lần bằng ethanol), mỏng che kín trên bề mặt silicagel sao cho không làm xáo trộn lớp silicagel, rửa thành cột bằng dung môi rửa giải. Khi lượng dung môi chảy xuống sát bề mặt silicagel, khóa cột và tiến hành đưa cắn lên cột.
- Đưa cắn lên cột: Hòa tan hoàn toàn cắn bằng một lượng tối thiểu dung môi rửa giải. Sử dụng pipet đưa dịch cắn lên cột vòng theo thành cột sao cho dịch cắn tiếp xúc đồng đều với bề mặt cát.
- Rửa giải: Sử dụng hỗn hợp dung môi n – hexan : ethyl acetat (98 : 2) . Hứng các phân đoạn vào từng ống nghiệm riêng biệt, mỗi phân đoạn khoảng 3 ml, tốc độ 20 giọt/ phút. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng λ = 254 nm, λ = 366 nm và sau khi phun thuốc thử vanilin/H2SO4, gộp các phân đoạn ống có sắc ký đồ giống nhau.
- Kết quả thu được một số phân đoạn, trong đó:
+ Từ ống 21 đến 27 sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat (95 : 5), trên sắc ký đồ cho 1 vết chất có giá trị Rf = 0,42, quan sát được dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm, không phát huỳnh quang dưới ánh sáng bước sóng λ = 366nm, cho màu hồng tím sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 ( ký hiệu PR1).
+ Từ ống 35 – 47 sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat (95 : 5) thì trên sắc ký đồ cho 1 vết chất có giá trị Rf = 0,29, quan sát được dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm, không phát huỳnh quang dưới ánh sáng bước sóng λ = 366nm, cho màu đỏ hồng sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 (ký hiệu PR2).
+ Từ ống 102 – 116 sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat (92 : 8) thì trên trên sắc ký đồ cho 1 vết chất có giá trị Rf = 0,29, quan sát được dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm, không phát huỳnh quang dưới ánh sáng bước sóng λ = 366nm, cho màu đỏ hồng sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 (ký hiệu PR3).
Các phân đoạn khác đều có nhiều vết chất và có hàm lượng ít nên chúng tôi chỉ chú trọng vào các phân đoạn trên.
Kiểm tra độ tinh khiết của 3 phân đoạn PR1, PR2, PR3 bằng sắc ký lớp mỏng trong 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau và sơ bộ xác định cấu trúc bằng phổ 1H – NMR.
PR1: PR1 sau khi để bay hơi tự nhiên hết dung môi thì thu được dạng tinh thể hình kim, màu vàng. Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng trong 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, trên sắc ký đồ đều cho thấy một vết chất chính có màu tím hồng sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4. Tuy nhiên khi quan sát sắc ký đồ sau khi khai triển ở hệ dung môi I và III ( hình 3.4), PR1 có khả năng không phải là một chất tinh khiết mà là một hỗn hợp các chất có cấu trúc tương tự nhau.
(a) (b) (c)
I: n – hexan : toluen (2 : 0,75) II: n – hexan : chloroform (1:1) III: n – hexan : ethyl acetat (9:1)
Hình 3.4 Sắc ký đồ PR1 ở 3 hệ dung môi dưới bước sóng λ= 254 nm(a), λ= 366nm (b) và sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 (c)
Kết quả phổ 1H – NMR cho phép dự đoán PR1 có thể là một hỗn hợp các triterpenoid. Tuy nhiên do lượng chất thu được quá nhỏ nên chúng tôi chưa có đủ điều kiện để tiếp tục tinh chế, phân lập và đo các phổ khác để xác định cấu trúc.
PR2: PR2 là chất lỏng, màu vàng. Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng trong 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Quan sát hình ảnh sắc ký đồ trong hai hệ dung môi I, II có thể nhận thấy tương tự PR1, PR2 có thể là một hỗn hợp các chất có cấu trúc tương tự nhau. Các chất này đều cho màu tím hồng sau khi phun thuốc thử vanilin/H2SO4 (hình 3.5)
PR2 cũng được dự đoán là một hỗn hợp triterpenoid dựa trên kết quả phổ cộng hưởng từ 1H – NMR. .
(a) (b) (c)
I : diethylether : chloroform (8:2) II : n – hexan : ethyl acetat (95:5) III : n – hexan : chloroform (1:9)
Hình 3.5 Sắc ký đồ PR2 ở 3 hệ dung môi dưới bước sóng λ = 254 nm (a), λ = 366nm (b) và sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 (c)
PR3: PR3 là tinh thể hình kim, hơi vàng. Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng trong 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, kết quả trên sắc ký đồ chỉ có 1 vết chất.
Giá trị Rf của PR3 trong 3 hệ dung môi khác nhau được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.6.
Bảng 3.2 Giá trị Rf của PR3 trong các hệ dung môi khác nhau
Hệ dung môi Tỷ lệ Rf
I: n – hexan : chloroform 6:4 0,16 II: n – hexan : EtOAc 92 : 4 0,38 III: chloroform : EtOAc 98:2 0,66
(a) (b) (c)
Hình 3.6 Sắc ký đồ PR3 ở 3 hệ dung môi dưới bước sóng λ = 254 nm(a), λ = 366nm (b) và sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 (c).
Kết quả phổ 1H – NMR cho thấy PR3 có thể là một triterpenoid. Tuy nhiên do lượng chất thu được quá nhỏ không cho phép chúng tôi đo được các phổ khác để xác định chính xác cấu trúc PR3.
3.3.3. Phân lập một số chất trong phân đoạn ethylacetat 3.3.3.1. Chuẩn bị cột sắc ký. 3.3.3.1. Chuẩn bị cột sắc ký.
- Cột sắc ký có chiều dài 65 cm, đường kính 4 cm được rửa sạch và làm khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng.
- Dung môi rửa giải : hỗn hợp dichloromethan: methanol (95:5).
- Chất nhồi cột: 120g silicagel cỡ hạt 43-60 µm (Merck) được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
- Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt.
- 1.80g cắn ethyl acetat được sử dụng để tiến hành phân lập.
3.3.3.2. Tiến hành chạy sắc ký cột.
- Nhồi cột: Cho một lượng vừa đủ hỗn hợp dung môi rửa giải dichloromethan: methanol (95 : 5) vào silicagel đã hoạt hóa, phân tán đều silicagel trong cốc có mỏ, rồi đổ thành dòng từ từ theo thành cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Rửa thành cột bằng dung
môi rửa giải. Ổn định cột bằng cách vừa mở khóa cột vừa dùng bơm áp lực dồn dung môi xuống cho đến khi silicagel không nén được nữa. Khi lượng dung môi chảy xuống sát bề mặt silicagel, khóa cột và tiến hành đưa cắn lên cột.
- Đưa cắn lên cột: Hòa tan hoàn toàn 1,80g cắn bằng một lượng tối thiểu methanol. Thêm một ít silicagel, trộn đều. Bay hơi hết dung môi, thu được dạng bột tơi mịn. Đưa cắn lên cột sao cho không làm xáo trộn lớp silicagel bề mặt.
- Rửa giải: Sử dụng gradient hỗn hợp dung môi dichoromethan và methanol. Hứng các phân đoạn vào từng ống nghiệm riêng biệt, mỗi phân đoạn khoảng 8 ml, tốc độ 20 giọt/ phút. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng λ = 254 nm, λ = 366 nm và sau khi phun thuốc thử vanilin/H2SO4, gộp các phân đoạn ống có sắc ký đồ giống nhau.
- Kết quả thu được 97 ống trong đó có phân đoạn gồm ống 1 đến 7 (ký hiệu là E1) sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat ( 95 : 5) quan sát thấy trên sắc ký đồ có 2 vết chất chính có giá trị Rf lần lượt là 0,29 và 0,60.
Các ống nghiệm còn lại gồm nhiều vết chất với hàm lượng ít, vì vậy chúng tôi tập trung chủ yếu tách phân đoạn trên.
3.3.3.3 Tinh chế phân đoạn E1
Tinh chế phân đoạn E1 bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel, dung môi rửa giải cột là n – hexan : ethyl acetat (98 : 2). Hứng 2-3 ml/ ống nghiệm. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n – hexan : ethyl acetat ( 95 : 5), qua sát đèn đèn tử ngoại và sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4, những ống nghiệm có sắc kí lớp mỏng giống nhau gộp thành một phân đoạn. Kết quả thu được 2 phân đoạn :
Phân đoạn 1(ký hiệu là E1’): Có một vết chất chính hiện màu tím hồng sau