2.2.1. Nội dung nghiên cứu
- Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong lá cây Lâm vồ bằng các phản ứng hóa học.
- Chiết xuất phân đoạn dịch chiết n – hexan và ethyl acetat từ lá cây Lâm vồ. - Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn n – hexan và ethyl acetat: định tính bằng sắc ký lớp mỏng, phân lập chất và dự đoán cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Xác định sự có mặt của một số nhóm chất hữu cơ bằng các phản ứng hóa học theo phương pháp mô tả trong tài liệu [2].
2.2.2.2. Chiết xuất phân đoạn dịch chiết n – hexan và ethyl acetat lá cây Lâm vồ Lá cây Lâm vồ được chiết hồi lưu với dung môi methanol. Dịch chiết toàn phần sau đó được cất thu hồi hết dung môi thu được dạng cao mềm. Cao mềm toàn phần sau đó được phân tán vào nước và được chiết lần lượt với n – hexan và ethyl acetat.
2.2.2.3. Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn n – hexan và ethyl acetat - Định tính phân đoạn n – hexan, ethyl acetat bằng sắc ký lớp mỏng.
- Phân lập một số chất trong phân đoạn n – hexan, ethyl acetat bằng phương pháp sắc ký cột.
- Sơ bộ nhận dạng cấu trúc các chất phân lập được bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton.
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
3.1. Xác định sự có mặt của một số nhóm chất hữu cơ trong lá cây Lâm vồ ( F. rumphii Blume) bằng các phản ứng hóa học rumphii Blume) bằng các phản ứng hóa học
3.1.1. Định tính glycosid tim
Cân khoảng 10g bột lá dược liệu khô đã tán nhỏ cho vào một bình nón dung tích 250ml. Thêm cồn 25% ngập dược liệu rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với hỗn hợp chloroform : ethanol (4:1) 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp chloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natri sulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô, bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng Liebermann - Burchardt
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn chloroform 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
kết quả: bề mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có 1 vòng màu tím đỏ (phản ứng dương tính).
Phản ứng Baljet
Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch natri hydroxyd 10%. Lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn chloroform 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ vài giọt thuốc thử Baljet.
Kết quả : So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn chloroform thấy ống thử không có màu đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính).
Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn chloroform 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch natri hydroxyd 10%. Lắc đều thì xuất hiện màu vàng nâu.
Kết quả : phản ứng âm tính
Phản ứng Keller – Killiani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn chloroform 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ (phản ứng dương tính).
Kết luận: Lá Lâm vồ không chứa glycosid tim.
3.1.2. Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Ðể yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
kết quả: bọt không bền vững sau 15 phút Kết luận: lá Lâm vồ không chứa saponin.
3.1.3. Định tính anthranoid
Phản ứng Borntraeger:
Cho 1g dược liệu vào bình nón 50 ml và 7ml dung dịch acid sulfuric 1N ngập dược liệu, đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc vào trong bình gạn dung tích 60ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 10ml chloroform. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp chloroform để làm phản ứng.
Kết quả: sau khi thêm 1 ml dung dịch amoniac thì lớp nước không có màu đỏ sim mà có màu vàng, tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch natri hydroxyd 10%. Lắc nhẹ. Lớp chloroform không mất màu mà vẫn có màu vàng, lớp nước không có màu đỏ sim mà vẫn có màu vàng (phản ứng âm tính).
- Lấy 1ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch natri hydroxyd 10%. Lắc nhẹ.
Kết quả: Lớp nước không có màu đỏ sim (phản ứng âm tính). Kết luận: lá Lâm vồ không có anthranoid.
3.1.4. Định tính triterpenoid, chất béo, flavonoid và coumarin
20 g bột dược liệu được chiết bằng Soxhlet với dung môi n- hexan trong 2h thu được dịch chiết n – hexan. Dịch chiết n – hexan được sử dụng để định tính sự có mặt của các hợp chất triterpenoid và chất béo. Phần bã dược liệu còn lại được bay hơi hết dung môi và chiết hồi lưu bằng cồn 90%. Dịch chiết cồn 90% được sử dụng để định tính flavonoid và coumarin.
3.1.4.1. Đinh tính triterpenoid và chất béo
Dịch chiết n – hexan được cô đặc lại còn khoảng 10ml.
Định tính chất béo: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, sấy cho bay hơi hết n – hexan.
Kết quả: Không có vết mờ trên giấy lọc (phản ứng âm tính). Kết luận: Lá Lâm vồ không chứa chất béo.
Định tính triterpenoid : Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn, thêm 1 ml chloroform, 1ml anhydrid acetic vào và lắc kỹ cho tan hết, nghiêng ống nghiệm 45 o sau thêm từ từ từng giọt H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả: bề mặt phân cách có màu tím đỏ (phản ứng dương tính). Kết luận: lá Lâm vồ có chứa triterpenoid.
3.1.4.2. Định tính flavonoid
Một phần dịch chiết cồn được đem cô đến cắn, cắn thu được đem hòa vào nước nóng và lọc nóng được dịch lọc. Dịch lọc này đem cô đến cắn, cắn thu được đem hòa tan vào ethanol 90 % để thực hiện các phản ứng định tính flavonoid.
Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)
- Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10 mg). Nhỏ từng giọt acid hydrochloric đậm đặc (3-5 giọt).
Kết quả: Ðể yên một vài phút, dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ (phản ứng dương tính).
Phản ứng với kiềm
- Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch natri hydroxyd 10%.
Kết quả: Xuất hiện tủa vàng, dung dịch có màu vàng đậm hơn (phản ứng dương tính).
- Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút.
Kết quả: Màu vàng của vết dịch chiết tăng lên (phản ứng dương tính).
Phản ứng với sắt (III) chlorid
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. kết quả: dung dịch có màu xanh lục (phản ứng dương tính).
Phản ứng diazo hoá
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vào đó 2 ml dung dịch natri hydroxyd 10%. Ðun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo.
Kết quả: dung dịch chuyển sang màu đỏ (phản ứng dương tính). Kết luận: Lá Lâm vồ có chứa flavonoid.
3.1.4.3. Định tính coumarin
Dịch chiết cồn 90% được sử dụng để thực hiện các phản ứng sau:
Phản ứng mở đóng vòng lacton - Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết
Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxyd 10% Ống 2 để nguyên
- Ðun cả 2 ống nghiệm đến sôi- để nguội Quan sát:
Ống1: có màu vàng và tủa đục màu vàng nhiều Ống 2: trong suốt
- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều. Quan sát:
Ống 1: tủa tan, dung dịch trong suốt Ống 2: trong suốt
- Thêm vào ống nghiệm 1 vài giọt acid hydrochlorid đặc. Quan sát: ống 1 không xuất hiện tủa.
Kết quả: phản ứng âm tính.
Phản ứng diazo hoá
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vào đó 2 ml dung dịch natri hydroxyd 10%. Ðun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo.
Kết quả: dung dịch chuyển sang màu đỏ (phản ứng dương tính).
Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm.
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch natri hydroxyd 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút.
Kết quả: Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang không sáng hơn phần bị che (phản ứng âm tính). Kết luận: lá Lâm vồ không chứa coumarin.
3.1.5. Định tính alcaloid
Cân 5 g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm dung dịch acid sulfuric 1 N ngập dược liệu. Ðun đến sôi. Ðể nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml. Kiềm hoá dịch lọc bằng dung dịch amoniac đậm đặc đến pH 9 - 10 (thử
bằng chỉ thị màu vạn năng). Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 8 ml). Gộp các dịch chiết chloroform để định tính alcaloid bằng thuốc thử chung.
Ðịnh tính alcaloid bằng thuốc thử chung
Lấy dịch chiết chloroform đã được chuẩn bị ở trên, đem lắc với dung dịch acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5 ml. Gộp các dịch chiết nước. Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
- Ống 1: Thuốc thử Mayer
Kết quả : không cho tủa màu từ trắng đến vàng (phản ứng âm tính). - Ống 2: thuốc thử Bouchardat
Kết quả: không cho tủa nâu đến đỏ nâu (phản ứng âm tính). - Ống 3: thuốc thử Dragendorff
Kết quả: không cho tủa vàng cam đến đỏ (phản ứng âm tính). Kết luận: Lá Lâm vồ không có alcaloid.
3.1.6. Định tính tanin, acid amin, đường khử, acid hữu cơ
Cho 5 g bột dược liệu và lượng nước cất vừa đủ ngập dược liệu vào bình nón 250ml, đun sôi 10 phút sau đó lọc qua bông được dịch lọc để thực hiện các phản ứng định tính.
Định tính tanin:
- Ống 1: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch sắt (III) chlorid 5%. Kết quả: xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính).
- Ống 2: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10%. Kêt quả: xuất hiện tủa bông (phản ứng dương tính).
- Ống 3: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Kết quả : không xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng âm tính). Kết luận: Lá Lâm vồ không chứa tanin.
Định tính acid amin: cho 2ml dịch chiết nước vào ống nghiệm nhỏ, nhỏ vài giọt thuốc thử ninhydrin 3% vào, sau đó đun cách thủy vài phút.
Kết quả: sau khi đun cách thủy vài phút thì thấy xuất hiện màu xanh tím (phản ứng dương tính).
Kết luận: Lá Lâm vồ chứa acid amin.
Định tính acid hữu cơ: cho 2 ml dịch chiết nước vào ống nghiệm nhỏ, thêm 1 ít tinh thể natri carbonat vào.
Kết quả: không thấy bọt khí nổi lên (phản ứng âm tính). Kết luận: Lá Lâm vồ không chứa acid hữu cơ.
Định tính đường khử: cho 2 ml dịch chiết nước vào ống nghiệm nhỏ, thêm 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml TT Fehling B vào, sau đó đun cách thủy vài phút.
Kết quả: xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính) Kết luận: lá Lâm vồ có chứa đường khử.
Như vậy qua kết quả của các phản ứng hóa học trên có thể kết luận lá cây Lâm vồ có chứa các hợp chất triterpenoid, flavonoid, acid amin và đường khử.
Kết quả định tính lá cây Lâm vồ được ghi ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả định tính một số nhóm chất trong lá cây Lâm vồ. STT Nhóm chất Tên phản ứng/ thuốc thử Kết quả Kết luận
1 Glycosid tim Liebermann – Burchardt (+) Không có TT Legal (-) TT Baljet (-) Keller – Killiani (+)
2 Saponin Tạo bọt (-) Không có
3 Anthranoid Borntraeger (-) Không có
4 Flavonoid Hơi amoniac (+) Có Natri hydroxyd (+) Cyanidin (+) Sắt (III) chlorid 5% (+) Diazo hóa (+)
5 Coumarin
Đóng mở vòng lacton (-)
Không có
Diazo hóa (+)
Quan sát huỳnh quang dưới
ánh sáng tử ngoại (-) 6 Tanin Sắt (III) chlorid 5% (+) Không có Chì acetat (+) Gelatin 1% (-) 7 Alcaloid TT Mayer (-) Không có TT Bouchardat (-) TT Dragendorff (-)
9 Chất béo Vết mờ xuất hiện trên giấy lọc (-) Không có 10 Triterpenoid Phản ứng Liebermann (+) Có
11 Acid amin TT Ninhydrin 3% (+) Có
12 Đường khử TT Fehling A+B (+) Có
13 Acid hữu cơ Natri carbonat (-) Không có
Từ kết quả định tính sơ bộ nói trên, n – hexan và ethyl acetat là hai dung môi được lựa chọn để chiết xuất phân đoạn cho mục tiêu nghiên cứu thành phần hóa học.
3.2. Chiết xuất phân đoạn dịch chiết n – hexan và ethyl acetat lá cây Lâm vồ
Cân 900g dược liệu đã tán nhỏ, chiết hồi lưu bằng methanol (chiết 2 lần, mỗi lần trong 2 giờ). Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc, cất thu hồi dung môi methanol dưới áp suất giảm thu được cao mềm (ký hiệu Ctp).
Phân tán Ctp vào 250ml nước, chuyển dịch phân tán vào bình gạn, thêm đồng thể tích n – hexan, chiết nhiều lần đến khi lớp n – hexan không còn màu xanh. Gộp dịch chiết n – hexan, loại nước bằng natri sulfat khan, cất thu hồi dưới áp suất giảm, sấy khô thu được cắn n – hexan (Cn-hexan; 23,26g).
Lớp nước còn lại tiếp tục chiết với ethyl acetat, chiết nhiều lần đến khi lớp ethyl acetat phản ứng âm tính với dung dịch amoniac đậm đặc. Gộp dịch chiết ethyl
acetat, loại nước bằng natri sulfat khan, cất thu hồi dưới áp suất giảm thu được cắn ethyl acetat ( ký hiệu CEtOAc; 1,81g).
Quy trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết n – hexan, ethyl acetat được tóm tắt trong sơ đồ hình 3.1.
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất phân đoạn n – hexan, ethyl acetat từ lá cây Lâm vồ. Dược liệu (900g) Dịch chiết MeOH toàn phần Ctp Lớp n – hexan Lớp nước CEtOAc(1,81g)
Lớp ethyl acetat Cn-hexan (23,26g) 1. Chiết hồi lưu, 2h / lần × 2 lần 2. Lọc
Lớp nước
Cất thu hồi dung môi
1.Phân tán vào 250ml nước.
2.Chiết với n – hexan (250ml× 4lần)
Chiết với ethyl acetat (250ml × 8 lần)
Cất thu hồi dung môi
Cất thu hồi dung môi Bã dược liệu
3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết n – hexan và ethyl acetat lá cây Lâm vồ
3.3.1. Định tính phân đoạn dịch chiết n – hexan, ethyl acetat lá cây Lâm vồ bằng sắc ký lớp mỏng.
3.3.1.1 Định tính phân đoạn dịch chiết n – hexan bằng sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị:
Dung dịch chấm sắc ký :
• Cắn n – hexan được hòa tan lại trong n – hexan để chấm sắc ký.
• Chất đối chiếu: β – sitosterol hòa tan trong chloroform (nồng độ 1 mg/ml).
Bản mỏng : bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
Hệ dung môi khai triển: n – hexan : ethyl acetat ( 85 : 15)
- Tiến hành: Sắc ký sau khi khai triển được để ngoài không khí cho bay hơi hết dung môi, quan sát các vết sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng λ = 254 nm, λ = 366 nm và sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4, sấy ở 110oC trong 10 phút.
- Kết quả được thể hiện qua sắc ký đồ hình 3.3 - Nhận xét:
Phân đoạn n – hexan khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm thấy xuất hiện một số vết chất có giá trị Rf nhỏ, dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 366 nm xuất hiện nhiều vết có huỳnh quang màu đỏ có thể là chlorophyll, sau khi phun thuốc thử hiện màu vanilin / H2SO4 thì xuất hiện ít nhất 7 vết chất có màu hồng tím không trùng với vết phát huỳnh quang màu đỏ ở ánh sáng tử ngoại λ