3.4.1. Tóm tắt quy trình phân lập các chất từ phân đoạn dịch chiết A2
Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn dịch chiết A2 hạt Cần tây được tóm tắt ở sơ đồ ở hình 3.9.
Hình 3.9: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các chất từ PĐ A2
3.4.2. Phân lập lần 1
Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel với chất nhồi cột là Sephadex LH20.
* Chuẩn bị cột
- Cột sắc ký kích thước (2,5cm x 50cm) được lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng Ethanol TĐ.Vặn khóa cột. Lót một lớp bông sạch dày khoảng 1cm ở đáy cột, lót một miếng giấy lọc sạch bằng đường kính cột trên lớp bông. Đưa từ từ Sephadex LH20đã ngâm trong Ethanol TĐ vào cột.
- Để cột ổn định trong 2-3 giờ.
- Lót miếng giấy lọc bằng đường kính cột lên trên bề mặt Sephadex.
* Chuẩn bị dịch chiết để đưa lên cột
- Lấy khoảng 2g cắn phân đoạn A2 hòa tan hoàn toàn trong lượng tối thiểu ethanol TĐ.
- Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ đến khi lớp dung môi trong cột gần sát bề mặt lớp Sephadex.
- Dùng pipet để đưa từ từ dịch cắn phân đoạn A2 hòa tan trong ethanol TĐ lên cột sao cho chiều cao lớp dịch chiết khoảng 0,5- 0,8cm, tránh xáo trộn cột.
- Mở khóa cột cho tới khi dịch chiết ethanol ngấm xuống hết lớp Sephadex thì cho một ít ethanol vào để rửa sạch dịch chiết bám trên thành cột. Đợi đến khi
Phân lập lần 2’ Phân lập lần 2 Phân lập lần 1’ Phân lập lần 1 PĐ A2 T3 T2 T1
dung môi trong cột gần sát lớp bề mặt Sephadex thì bổ sung thêm ethanol một cách nhẹ nhàng, tránh xáo trộn.
* Rửa giải
- Sử dụng dung môi chạy cột là Ethanol TĐ.
- Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 4 giây/giọt.
- Dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm nhỏ sạch đã được làm khô, đánh số thứ tự, mỗi ống hứng khoảng 5ml dịch rửa giải ở nhiệt độ phòng.
- Để các ống nghiệm bay hơi tự nhiên.
- Kiểm tra dịch rửa giải ở các ống bằng sắc ký lớp mỏng, với hệ dung môi I: Chloroform : Ethanol : Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới)
- Quan sát vết dưới ánh sáng thường, UV 254nm và UV 366nm, hiện màu bằng hơi NH3 đặc.
* Kết quả
- Từ ống 1 đến ống 264: Trên sắc ký đồ có hai vết rõ ở đèn UV254và nhiều vết mờ, gộp các ống thành một phân đoạn, ký hiệu là PĐ1.
- Từ ống 265 trở đi: Trên sắc ký đồ xuất hiện thêm một vết màu vàng rõ ở UV366 tách xa các vết còn lại. Rửa giải cột cho đến khi trên sắc ký đồ dịch rửa giải không còn vết màu vàng nữa. Gộp các ống thu được PĐ2.
Như vậy, sau khi phân lập lần 1, từ dịch chiết ban đầu thu được 2 phân đoạn ký hiệu là PĐ1, PĐ2. Các phân đoạn đem cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm và để bay hơi tự nhiên đến cắn.
3.4.3. Phân lập lần 2
Sử dụng phương pháp sắc ký chế hóa với chất hấp phụ là Silicagel G có cỡ hạt: 5 - 40 µm (Viện kiểm nghiệm).
* Chuẩn bị
- Chuẩn bị các tấm kính phẳng đã được rửa sạch, sấy khô, có kích thước 20x20.
- Nước lọc thẩm thấu ion được lọc qua giấy lọc loại bỏ cặn. - Giá đỡ bằng nhôm đã được rửa sạch làm khô.
- Chuẩn bị một bình thủy tinh chạy sắc ký sạch và khô.
* Chuẩn bị bản mỏng
- Lấy một lượng Silicagel vừa đủ cho vào cốc sạch, khô. Thêm nước từ từ đồng thời dùng đũa thủy tinh sạch khuấy đều đến khi tạo thành một hỗn dịch đồng nhất.
- Nhanh tay đổ hỗn dịch Silicagel vừa tạo thành ở trên lên bề mặt tấm kính một cách đều đặn sao cho tạo thành một lớp Silicagel mỏng, đều, phẳng trên tấm kinh.
- Tấm kính sau khi tráng Silicagel được để vào giá đỡ và để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Khi bề mặt Silicagel khô thì đem đi hoạt hóa trong tủ sấy ở nhiệt độ 1100
C trong 60 phút.
* Tiến hành khai triển sắc ký
- Hòa tan hoàn toàn cắn PĐ2 trong một lượng tối thiểu Ethanol TĐ, sau đó đem cô cách thủy thu được dịch chấm sắc ký.
- Hệ dung môi chạy sắc ký là hệ I:
Chloroform : Ethanol : Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới)
- Sử dụng mao quản thủy tinh đường kính 1mm chấm dải trên bản mỏng chế hóa đã được hoạt hóa. Sau đó đặt bản mỏng chế hóa vào bình chạy sắc ký và đợi cho dung môi chạy đến vạch thì nhấc ra để bay hơi hết dung môi.
- Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm thấy có một dải màu vàng rõ ở đèn UV366.
- Sử dụng dao lam sạch cạo lấy lớp silicagel có vết màu vàng ở UV366vào một cốc thủy tinh có nút mài sạch, đậy kín.
- Tiến hành sắc ký chế hóa lặp lại với 2 bản mỏng khác, gộp các lớp silicagel có vết màu vàng vào cốc thủy tinh trên.
* Phản hấp phụ
- Sử dụng cột sắc ký kích thước 1,5 x 50 cm, sạch và khô, lót một lớp bông dày khoảng 1cm.
- Rót một lượng vừa đủ Methanol TĐ vào cốc có mỏ sạch chứa lớp bột Silicagel cạo được, khuấy đều tạo thành hỗn dịch. Đổ từ từ hỗn dịch lên cột theo thành cột. Dùng pipet rửa thành cột bằng Methanol TĐ. Vặn cho cột chảy nhỏ giọt với tốc độ 5 giây/giọt. Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi I.
- Chất rửa giải được, đem đi cất thu hồi dung môi, cô cách thủy đến cắn, ký hiệu là T1.
* Kiểm tra độ tinh khiết của chất T1
Lấy một phần cắn T1 hòa tan vào methanol rồi kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi sau:
Hệ I: Chloroform : Ethanol : Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới) Hệ V: Ethyl acetat : Methanol : Nước (100 : 17 : 13) Hệ VIII: Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (5: 8 : 1,5)
Quan sát sắc ký đồ ở ánh sáng thường, UV 254nm, UV 366nm và hiện màu bằng hơi NH3.
Hệ I Hệ V Hệ VIII UV 366 nm
Hình 3.10: Ảnh chụp sắc ký đồ chất T1 ở 3 hệ dung môi I, V, VIII
Kết quả, trên sắc ký đồ ở cả 3 hệ dung môi I, V, VIII, T1 đều cho 1 vết ở UV 366nm (Hình 3.10) có Rflần lượt bằng 0,52 ; 0,14 và 0,17. Vết này không màu ở
ánh sáng thường, UV 254 nm và sau khi hơ qua NH3. Do đó có thể sơ bộ kết luận T1 tương đối tinh khiết.
3.4.4. Phân lập lần 1’
* Chuẩn bị cột: tiến hành tương tự như các bước ở mục 3.4.2.
* Chuẩn bị dịch chiết đưa lên cột: tiến hành tương tự như các bước ở mục 3.4.2.
* Rửa giải
- Sử dụng dung môi chạy cột là Ethanol tuyệt đối.
- Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 4 giây/giọt.
- Dịch rửa giải được hứng vào các các có mỏ 100 ml sạch đã được làm khô, đánh số thứ tự, mỗi cốc hứng khoảng 100 ml dịch rửa giải ở nhiệt độ phòng. Để bay hơi tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
- Kiểm tra dịch rửa giải ở các cốc bằng SKLM, với hệ dung môi I: Chloroform : Ethanol : Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới)
- Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường, UV 254nm và UV 366nm, hiện màu bằng hơi NH3đặc.
* Kết quả
- Từ cốc 1 đến cốc 12: Trên sắc ký đồ có hai vết rõ ở đèn UV254 và nhiều vết mờ ở đèn UV366, gộp các cốc lại, ký hiệu là PĐ1’.
- Từ cốc 13 đến cốc 29: Trên sắc ký đồ cho thấy 3 vết, ngoài 2 vết rõ ở đèn UV254 thì có thêm 1vết màu vàng rõ ở đèn UV366. Rửa giải cột cho đến khi trên sắc ký đồ dịch rửa giải không còn vết màu vàng ở UV366 nữa. Gộp các cốc lại thu được PĐ2’.
Như vậy, sau khi phân lập lần 1’, từ dịch chiết ban đầu thu được 2 phân đoạn ký hiệu là PĐ1’ và PĐ2’. Các phân đoạn đem cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm và để bay hơi tự nhiên đến cắn.
3.4.5. Phân lập lần 2’
Tiến hành phân lập lần 2 với PĐ2’ bằng phương pháp SKCH với chất hấp phụ là Silicagel tiến hành tương tự như các bước ở mục 3.4.3.
* Tiến hành khai triển SKCH
- Hòa tan hoàn toàn cắn PĐ2’ trong một lượng tối thiểu Ethanol TĐ, sau đó đem cô cách thủy thu được dịch chấm sắc ký đặc.
- Hệ dung môi chạy sắc ký là hệ I:
Chloroform : Ethanol : Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới)
- Sử dụng mao quản thủy tinh đường kính 1mm chấm dải trên bản mỏng chế hóa đã được hoạt hóa. Sau đó đặt bản mỏng chế hóa vào bình chạy sắc ký và đợi cho dung môi chạy đến vạch thì nhấc ra để bay hơi hết dung môi.
- Quan sát dưới ánh sáng UV254 và UV366 thì thấy 2 vết cách xa nhau, một vết màu đen ở đèn UV254, ký hiệu là T2và một vết màu vàng sáng rõ ở đèn UV366, ký hiệu là T3.
- Sử dụng dao lam sạch cạo lấy lớp silicagel có chứa vết T2, T3 vào hai cốc thủy tinh có nút mài sạch, đậy kín.
* Phản hấp phụ
- Rót một lượng vừa đủ Methanol TĐ vào cốc có mỏ sạch chứa lớp bột Silicagel cạo được từ vết T2, khuấy đều tạo thành hỗn dịch. Đổ từ từ hỗn dịch lên cột theo thành cột. Dùng pipet rửa thành cột bằng Methanol TĐ. Vặn cho cột chảy nhỏ giọt với tốc độ 5 giây/giọt. Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi I.
- Chất rửa giải được, đem đi cất thu hồi dung môi, cô cách thủy đến cắn, ký hiệu là T2. Làm tương tự các bước trên ta cũng thu được chất T3.
* Kiểm tra độ tinh khiết của chất T2
Lấy một phần cắn T2 hòa tan vào methanol rồi kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi sau:
Hệ I: Chloroform : Ethanol : Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới) Hệ V: Ethyl acetat : Methanol : Nước (100 : 17 : 13) Hệ IX: Ethyl acetat : Methanol (4 : 1)
Quan sát sắc ký đồ ở ánh sáng thường, UV 254nm, UV 366nm và hiện màu bằng hơi NH3.
Kết quả, trên sắc ký đồ ở cả 3 hệ dung môi I, V và IX, T2 đều cho 1 vết màu đen ở UV 254nm (Hình 3.11), vết này cho màu vàng nhạt sau khi hiện màu bằng hơi NH3 có Rf lần lượt bằng 0,50 ; 0,37 và 0,40. Vết này không màu ở ánh sáng thường, UV 366nm. Do đó có thể sơ bộ kết luận T2tương đối tinh khiết.
Hệ I Hệ V Hệ IX UV 254 nm
Hình 3.11: Ảnh chụp sắc ký đồ chất T2ở 3 hệ dung môi I, V, IX * Kiểm tra độ tinh khiết của chất T3
Lấy một phần cắn T3 hòa tan vào methanol rồi kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi sau:
Hệ I: Chloroform : Ethanol : Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới) Hệ V: Ethyl acetat : Methanol : Nước (100 : 17 : 13) Hệ VIII: Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (5: 8 : 1,5)
Quan sát sắc ký đồ ở ánh sáng thường, UV 254nm, UV 366nm và hiện màu bằng hơi NH3.
Kết quả, trên sắc ký đồ ở cả 3 hệ dung môi I, V, VIII, T3 đều cho 1 vết ở UV 366nm (Hình 3.12) có Rf lần lượt bằng 0,26 ; 0,21 và 0,32 . Tuy nhiên ở hệ V có một số vết mờ ở trên và dưới vết chất T3. Cả vết T3 lẫn các vết lạ ở hệ V đều không màu ở ánh sáng thường, UV 254 nm và sau khi hơ qua NH3. Do đó có thể sơ bộ kết luận T3 không tinh khiết.
Hệ I Hệ V Hệ VIII UV 366 nm
Hình 3.12: Ảnh chụp sắc ký đồ chất T3ở 3 hệ dung môi I, V, VIII 3.5. Sơ bộ nhận dạng các chất phân lập từ PĐ A2 hạt Cần tây
3.5.1. Độ tan
Tiến hành thử độ tan của T1, T2, T3 trong một số dung môi có độ phân cực giảm dần
Độ tan của T1, T2, T3 được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Độ tan của các chất T1, T2, T3
Methanol Ethanol EtOAc CHCl3 Toluen
T1 ++ ++ + + +
T2 ++ ++ + + +
T3 ++ ++ + + +
Ghi chú:
(++): Tan hoàn toàn (+): Tan một phần (-): Không tan
Nhận xét: Các chất T1, T2, T3 đều tan hoàn toàn trong Ethanol TĐ và Methanol TĐ, tan một phần trong các dung môi Ethyl acetat, Chloroform, Toluen.
3.5.2. Định tính các chất T1, T2, T3bằng phản ứng hóa học
Lấy một ít cắn T1, T2, T3 hòa tan hoàn toàn trong Methanol TĐ thu được các dịch chiết Methanol tương ứng để làm các phản ứng định tính flavonoid [3].
- Phản ứng Cyanidin: Cho khoảng 1ml dịch chiết Methanol vào ống nghiệm
sạch, thêm một ít bột Magie kim loại và vài giọt HCl đặc, lắc đều và đun nóng cách thủy thấy dung dịch mất màu vàng, hơi ánh hồng ở cả 3 chất T1, T2, T3.
- Phản ứng với kiềm:
Phản ứng với dd NaOH 10%: Cho 1ml dịch chiết Methanol vào ống nghiệm sạch, thêm vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện tủa trắng, thêm 1ml nước cất thấy tủa tan và màu của dung dịch trong ống nghiệm không đậm lên (với chất T1 và T3), tủa không tan (với chất T2).
Phản ứng với NH3 đặc: Nhỏ một giọt dịch chiết Methanol lên giấy lọc, cho bay hơi hết, hơ tờ giấy lọc qua lại trên miệng bình NH3 đặc thấy màu không thay đổi (với chất T1 và T3), màu vàng đậm lên (với chất T2).
Kết quả định tính các chất T1, T2, T3được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả định tính các chất T1, T2, T3
Phản ứng Cyanidin NaOH 10% Hơi NH3đặc
T1 + + - T2 + - ++ T3 + + - Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính (+): Phản ứng dương tính (++): Phản ứng dương tính rõ
Nhận xét: Các chất T1, T2, T3 đều cho kết quả dương tính với phản ứng Cyanidin, đều phản ứng với kiềm (hai chất T1, T3 dương tính với dung dịch NaOH 10%, chất T2 dương tính với hơi NH3 đặc). Do đó có thể sơ bộ kết luận ba chất T1, T2, T3 đều thuộc nhóm flavonoid.
BÀN LUẬN
Từ rất lâu đời hạt Cần tây được sử dụng trong dân gian ta để chữa cao huyết áp, thấp khớp, lợi tiểu…[6], [14]. Đồng thời, các nghiên cứu gần đây trên thế giới đã bắt đầu chú ý tới hạt Cần tây và đã chứng minh hạt Cần tây có tác dụng hạ huyết áp [39], chống ung thư [35], chống loét dạ dày [45], chống viêm [33], kháng khuẩn [28],… đã gợi ý để chúng tôi chọn hạt Cần tây để nghiên cứu.
Dựa trên những tài liệu thu thập được, flavonoid và tinh dầu là hai nhóm chất có trong hạt Cần tây được nghiên cứu nhiều hơn cả. Ngoài ra còn có một số nhóm chất khác như coumarin, acid béo, triglycerid ít được nghiên cứu hơn. Trong nhóm flavonoid, apigenin (1) và dẫn chất được nghiên cứu nhiều nhất và có một số tác dụng nổi trội đó là giãn mạch [38], ức chế men chuyển, chẹn kênh canxi [26], do đó giúp làm hạ huyết áp nhanh chóng, tác dụng chống viêm [27], chống kết tập tiểu cầu [37], [46], do đó giúp làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch như đột quỵ, tai biến mạch máu não,… Trong nhóm tinh dầu, 3nB (11) là hoạt chất được nghiên cứu khá đầy đủ với nhiều tác dụng dược lý quan trọng như hạ huyết áp [39], chống viêm [31], giải độc gan [21],… Do đó có thể kết luận flavonoid và tinh dầu là hai nhóm hoạt chất quan trọng có trong hạt Cần tây.
Ở Việt Nam những năm gần đây chưa có nhiều nghiên cứu về hạt Cần tây. Hơn nữa đây là lần đầu tiên phân đoạn A2 được tiến hành nghiên cứu. Khi chiết xuất các phân đoạn dịch chiết, PĐ A2 được tách ra với một khối lượng lớn. Định tính phân đoạn này bằng phản ứng hóa học cho kết quả dương tính rất rõ với các phản ứng định tính flavonoid, âm tính với các phản ứng định tính coumarin, tannin, và chất béo, cho nên có thể kết luận sơ bộ rằng phân đoạn dịch chiết A2 chứa chủ yếu flavonoid. Đó cũng chính là lý do chúng tôi quyết định chọn PĐ A2 để nghiên cứu.
Định tính phân đoạn A2 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, kết quả cho thấy các hệ dung môi có độ phân cực cao và có chứa Toluen, Ethyl acetat, acid formic thì vết chất tách nhau khá rõ. Dịch