2.3.1. Chiết xuất
Chiết xuất dịch chiết Ethanol hạt Cần tây bằng phương pháp ngâm lạnh với Ethanol tuyệt đối (TĐ) ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết Ethanol hạt Cần tây thu được đem cất quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch chiết đặc. Thêm nước cất đun nóng rồi đem lắc phân đoạn với các dung môi hữu cơ theo thứ tự tăng dần độ phân cực: n-hexan, CHCl3, ethyl acetat. Các dịch chiết phân đoạn thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn phân đoạn. Phân đoạn A2 là phần tủa không tan trong nước nằm giwuax lớp dịch chiết than dầu và lớp dịch chiết than nước được tạo ra trong quá trình thêm nước cất đun nóng vào dịch chiết đậm đặc ở trên. Dùng pipet gạn lấy phân đoạn dịch chiết A2.
2.3.2. Định tính
Định tính flavonoid, tanin, coumarin và chất béo trong phân đoạn A2 bằng phản ứng hóa học theo tài liệu và bằng SKLM [3].
2.3.3. Phân lập
2.3.3.1. Phương pháp sắc ký lọc gel
Tiến hành theo phương pháp ghi trong tài liệu [4]:
Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel với pha tĩnh là Sephadex LH20.
Một hỗn dịch chứa pha tĩnh gồm nhiều hạt xốp được nhồi vào một cột thủy tinh. Nếu mẫu thử gồm các cấu tử có kích thước phân tử khác nhau thì:
- Các cấu tử lớn hơn kích thước xoang sẽ chỉ nằm ở khe các hạt, không xâm nhập các xoang được và nhanh chóng theo pha động này thoát ra ngoài trước.
- Các cấu tử nhỏ hơn kích thước xoang có thể xâm nập các xoang xốp của hạt, bị lưu giữ tạm thời trong các xoang xốp này, sau đó mới di chuyển dần dần theo pha động và thoát ra sau.
Quá trình “bị bẫy vào xoang - bị lưu giữ - thoát ra khỏi xoang” này xảy ra liên tục suốt chiều dài của cột, kết quả là các cấu tử nhỏ thoát ra khỏi cột
chậm hơn tử lớn. Ta nói đã xảy ra quá trình sắc ký lọc gel. Đoạn đường di chuyển, thời gian lưu của các cấu tử “lớn” và “bé” sẽ càng khác biệt nếu chiều dài cột càng lớn.
2.3.3.2. Phương pháp sắc ký chế hóa
Tiến hành theo phương pháp ghi trong tài liệu [4]:
Một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là silicagel) được tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh.
Một hoặc một hệ dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ hạt Cần tây
Hạt Cần tây tán thành bột thô bằng máy xay. Xác định độ ẩm bằng máy đo độ ẩm Precisa HA60 ở nhiệt độ 1100
C trong 10 phút cho kết quả độ ẩm dược liệu là 8,71%. Cân 5 kg bột hạt Cần tây đã xay nhỏ cho vào một khay men, thêm 500 ml Ethanol TĐ để thấm ẩm dược liệu, trộn đều. Lót một miếng giấy lọc ở đáy bình ngấm kiệt, cho dược liệu đã thấm ẩm vào bình, lót một miếng giấy lọc bằng đường kính bình lên trên dược liệu. Thêm Ethanol TĐ ngập trên dược liệu 2-3cm. Đậy nắp bình và ngâm trong 5 ngày, rút lấy dịch chiết lần 1. Bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2-3cm và ngâm trong 3 ngày, rút lấy dịch chiết lần 2. Bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2-3cm và tiếp tục ngâm trong 3 ngày, rút lấy dịch chiết, vừa rút vừa bổ sung thêm dung môi sao cho dung môi luôn ngập trên dược liệu 2-3cm, khi dịch chiết thu được trong suốt, không màu thì ngừng bổ sung dung môi, rút hết dịch chiết trong bình thu được dịch chiết lần 3. Gộp dịch chiết 3 lần đem cất thu hồi Ethanol dưới áp suất giảm thu được khoảng 500ml dịch chiết đặc. Hòa tan dịch chiết đặc trong nước nóng theo tỷ lệ 1:1 thu được dịch chiết nước, tủa (phân đoạn A2) và dịch chiết thân dầu. PĐ A2 được tách ra bằng cách dùng pipet sạch tách riêng lớp dịch dầu ở trên, sau đó lọc lấy tủa ra một cốc có mỏ sạch (gọi là PĐ A2) rửa lại tủa bằng n-hexan, sau đó đem PĐ A2 đã được tách riêng đi đun cách thủy ở 600C loại hết dung môi, thu được cắn PĐ A2. Dịch chiết nước đem lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, CHCl3, ethyl acetat thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng. Do dịch chiết thân dầu có thể hòa tan hoàn toàn trong n-hexan nên chúng tôi quyết định gộp chung phần dịch chiết thân dầu với dịch chiết n-hexan và gọi là phân đoạn dịch chiết n-hexan hạt Cần tây. Các phân đoạn dịch chiết được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 60ºC đến cắn thu được các cắn tương ứng ký hiệu là A, B, C.
Hình 3.5: Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ hạt Cần tây. Ngâm 5 ngày Rút dịch chiết Bình ngấm kiệt Bã dược liệu EtOH TĐ Ngâm 3 ngày Rút dịch chiết Dịch chiết lần 1 Dịch chiết cồn Cất thu hồi cồn Dịch chiết lần 2,3 Dịch chiết đặc Nước nóng (1:1) Dịch chiết nước PĐ A2
Dịch chiết thân dầu
n-hexan nhiều lần Dịch chiết n-hexan
Dịch chiết nước
CHCl3 nhiều lần Cất thu hồi n-hexan
Cắn A Dịch chiết nước EtOAc nhiều lần Dịch chiết nước Dịch chiết CHCl3 Dịch chiết EtOAc
Cô cách thủy Cất thu hồi EtOAc Cắn D Cắn B Cắn C Cất thu hồi CHCl3 Khay men EtOH TĐ Thấm ẩm EtOH TĐ
3.2. Định tính flavonoid, coumarin, tanin và chất béo trong phân đoạn dịch chiết A2bằng phản ứng hóa học chiết A2bằng phản ứng hóa học
Lấy khoảng 2g cắn PĐ A2 hòa tan trong Ethanol tuyệt đối, lọc qua giấy lọc thu được dịch chiết Ethanol để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, tanin và chất béo.
3.2.1. Phản ứng định tính flavonoid
- Phản ứng Cyanidin: Cho khoảng 2ml dịch chiết Ethanol vào ống nghiệm sạch, thêm một ít bột Magie kim loại và vài giọt HCl đặc, lắc đều và đun nóng cách thủy thấy xuất hiện màu đỏ cam (+). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phản ứng với kiềm:
Phản ứng với dd NaOH 10% : Cho 1ml dịch chiết Ethanol vào ống nghiệm, thêm vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1ml nước cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch trong ống nghiệm tăng lên (+).
Phản ứng với NH3 đặc: Nhỏ một giọt dịch chiết Ethanol lên giấy lọc, cho bay hơi hết, hơ tờ giấy lọc qua lại trên miệng bình NH3 đặc thấy màu vàng đậm lên (+).
- Phản ứng với dd FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết Ethanol,
thêm vào 1-2 giọt FeCl3 5% thấy xuất hiện tủa màu xanh đen (+).
Kết luận:Trong phân đoạn dịch chiết A2có chứa Flavonoid.
3.2.2. Định tính courmarin
Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch hòa tan cắn Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%
Ống 2: để nguyên
-Đun cả 2 ống đến sôi, để nguội, quan sát thấy: Ống 1: trong suốt, không có tủa
Ống 2: trong suốt
-Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát thấy Ống 1: trong suốt
Ống 2: trong suốt
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, cả 2 ống đều trong suốt. Kết quả: phản ứng âm tính (-)
Quan sát hiện tượng huỳnh quang: Nhỏ 2-3 giọt dịch hòa tan cắn lên một miếng giấy lọc. Nhỏ 2-3 giọt dung dịch NaOH 5% lên vị trí có dịch chiết. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch hòa tan cắn trên giấy lọc bằng một miếng kim loại, chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng như phần bị che.
Kết quả: phản ứng âm tính (-)
Kết luận:Phân đoạn dịch chiết A2 chiết từ hạt Cần tây không chứa coumarin.
3.2.3. Định tính tanin
Lấy khoảng 2g cắn PĐ A2 hòa tan trong nước, lọc qua giấy lọc thu được dịch chiết nước để làm các phản ứng định tính tanin.
- Phản ứng với dung dịch FeCl35%: Cho khoảng 1ml dịch chiết nước vào ống
nghiệm sạch, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% thấy xuất hiện kết tủa màu nâu đen (+).
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho khoảng 1ml dịch chiết nước vào
ống nghiệm sạch, thêm 2-3 giọt dung dịch gelatin 1% không thấy xuất hiện tủa bông trắng (-).
- Phản ứng với chì acetat: Cho khoảng 1ml dịch chiết nước vào ống nghiệm
sạch, thêm 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10% thấy xuất hiện tủa bông (+).
Kết luận:Phân đoạn dịch chiết A2 chiết từ hạt Cần tây không chứa tanin.
3.2.4. Định tính chất béo
Lấy khoảng 50mg cắn PĐ A2 hòa tan trong Ether dầu hỏa, gạn lấy dịch chiết để làm phản ứng định tính chất béo.
Nhỏ 2 giọt dịch chiết Ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi thấy không có vết mờ trên giấy lọc (-). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết A2 hạt Cần tây được trình bày tóm tắt ở bảng 3.8.
Bảng 3.8: Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết A2từ hạt Cần tây Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận Flavonoid Phản ứng Cyanidin Phản ứng với kiềm Phản ứng với dd FeCl3 +++ ++ +++ Có Flavonoid Coumarin Phản ứng mở, đóng vòng lacton Quan sát hiện tượng huỳnh quang - - Không có Coumarin Tanin Phản ứng với dd FeCl3 Phản ứng với dd Gelatin Phản ứng với dd Pb(CH3COO)2 + - ++ Không có tanin
Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - Không có chất béo
Ghi chú:
(-): Phản ứng âm tính (++) : Phản ứng dương tính rõ (+): Phản ứng dương tính (+++) : Phản ứng dương tính rất rõ
Kết luận: Từ kết quả ở bảng 3.8 cho thấy PĐ dịch chiết A2 từ hạt Cần tây có chứa flavonoid, không chứa coumarin, tannin và chất béo.
3.3. Định tính phân đoạn dịch chiết A2bằng sắc ký lớp mỏng
- Hòa tan khoảng 2g cắn phân đoạn A2 trong 20ml methanol, lọc qua giấy lọc, đem cô cách thủy thu được dịch chiết đặc dùng làm dịch chấm sắc ký.
- Bản mỏng Silicagel F254 được hoạt hóa ở 110º trong 1giờ. - Triển khai sắc ký với các hệ dung môi sau:
Hệ I: Chloroform : Ethanol: Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới) Hệ II: Chloroform : Methanol : Acid acetic (7 : 1 : 1) Hệ III: Ethyl acetat : Toluen : Methanol (8 : 4 : 1)
Hệ IV: Ethyl acetat : Acid formic : Chloroform (4 : 1 : 1) Hệ V: Ethyl acetat : Methanol : Nước (100 : 17 : 13) Hệ VI: Toluen : Ethyl acetat : Methanol (8 : 6 : 1)
Hệ VII: Toluen : Ethyl acetat : Acid formic : Nước (3 : 7 : 1,5 : 1) Hệ VIII: Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (5 : 8 : 1,5)
Quan sát vết dưới ánh sáng tử ngoại ở các bước sóng 254nm và 366nm và hiện màu bằng hơi NH3. Kết quả SKLM phân đoạn dịch chiết A2 hạt Cần tây với hệ I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII được trình bày tương ứng ở các sắc ký đồ hình 3.6, 3.7, 3.8.
Kết quả cho thấy các hệ I không phân tách; Hệ II, IV, V, VII có phân tách nhưng không rõ, các vết xếp sít nhau và có hiện tượng kéo vết; Hệ III, VI, VIII phân tách tốt. Trong đó hệ VIII tách tốt nhất, cho 18 vết. Quan sát vết dưới ánh sáng tử ngoại ở các bước sóng 254nm và 366nm và sau khi hiện màu bằng hơi NH3 đặc. Kết quả định tính bằng SKLM PĐ A2 với hệ dung môi VIII được trình bày ở bảng 3.9 và ở sắc ký đồ hình 3.8.
254nm 366nm 254nm 366nm
UV254 UV366 Hơi NH3
Hình 3.8: Ảnh chụp sắc ký đồ PĐ A2với hệ dung môi VIII
Hình 3.7: Ảnh chụp sắc ký đồ PĐ A2
với hệ dung môi VI Hình 3.6: Ảnh chụp sắc ký đồ PĐ A2
Bảng 3.9: Kết quả SKLM PĐ A2 với hệ dung môi VIII
STT Rf X100
AST UV254 UV365 Hơi NH3 đặc Màu Độ
đậm Màu đậm Màu Độ đậm Màu Độ đậm Độ 1 3,8 Nâu ++ Đen ++ Xanh
dương ++ Nâu ++
2 8,7 Nâu ++ Đen ++ - - Nâu ++
3 14,7 - - Đen + - - Nâu + 4 19 - - - - Xanh lơ ++ - - 5 27,2 - - - - Xanh lơ ++ - - 6 30,6 - - Đen + - - - - 7 32,9 - - - - Xanh lơ ++ - - 8 36,9 - - Đen + - - - - 9 38 - - - - Xanh lơ ++ - - 10 42,5 - - Đen ++ - - - - 11 44,3 - - - - Xanh lơ +++ - - 12 47,5 - - Đen ++ - - Nâu ++ 13 53,2 - - - - Xanh dương ++ - - 14 55 - - Đen ++ - - - - 15 57,6 - - - - Hồng ++ Nâu ++ 16 61,3 - - Đen ++ - - - - 17 63,1 - - - - Hồng + - - 18 78,3 - - - - Vàng + - -
Ghi chú: (+++): đậm ; (++): hơi đậm ; (+): Mờ ; (-): Không hiện vết
Nhận xét: Dịch chiết PĐ A2 của hạt Cần tây khi khai triển SKLM với hệ dung môi VIII cho 18 vết, trong đó vết 1, 4, 5, 7, 9, 11, 13 hấp thụ UV366 mạnh nhất nên có thể dự đoán các vết này là flavonoid. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4. Phân lập chất từ phân đoạn dịch chiết A2 hạt Cần tây
3.4.1. Tóm tắt quy trình phân lập các chất từ phân đoạn dịch chiết A2
Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn dịch chiết A2 hạt Cần tây được tóm tắt ở sơ đồ ở hình 3.9.
Hình 3.9: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các chất từ PĐ A2
3.4.2. Phân lập lần 1
Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel với chất nhồi cột là Sephadex LH20.
* Chuẩn bị cột
- Cột sắc ký kích thước (2,5cm x 50cm) được lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng Ethanol TĐ.Vặn khóa cột. Lót một lớp bông sạch dày khoảng 1cm ở đáy cột, lót một miếng giấy lọc sạch bằng đường kính cột trên lớp bông. Đưa từ từ Sephadex LH20đã ngâm trong Ethanol TĐ vào cột.
- Để cột ổn định trong 2-3 giờ.
- Lót miếng giấy lọc bằng đường kính cột lên trên bề mặt Sephadex.
* Chuẩn bị dịch chiết để đưa lên cột
- Lấy khoảng 2g cắn phân đoạn A2 hòa tan hoàn toàn trong lượng tối thiểu ethanol TĐ.
- Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ đến khi lớp dung môi trong cột gần sát bề mặt lớp Sephadex.
- Dùng pipet để đưa từ từ dịch cắn phân đoạn A2 hòa tan trong ethanol TĐ lên cột sao cho chiều cao lớp dịch chiết khoảng 0,5- 0,8cm, tránh xáo trộn cột.
- Mở khóa cột cho tới khi dịch chiết ethanol ngấm xuống hết lớp Sephadex thì cho một ít ethanol vào để rửa sạch dịch chiết bám trên thành cột. Đợi đến khi
Phân lập lần 2’ Phân lập lần 2 Phân lập lần 1’ Phân lập lần 1 PĐ A2 T3 T2 T1
dung môi trong cột gần sát lớp bề mặt Sephadex thì bổ sung thêm ethanol một cách nhẹ nhàng, tránh xáo trộn.
* Rửa giải
- Sử dụng dung môi chạy cột là Ethanol TĐ.
- Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 4 giây/giọt.
- Dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm nhỏ sạch đã được làm khô, đánh số thứ tự, mỗi ống hứng khoảng 5ml dịch rửa giải ở nhiệt độ phòng.
- Để các ống nghiệm bay hơi tự nhiên.
- Kiểm tra dịch rửa giải ở các ống bằng sắc ký lớp mỏng, với hệ dung môi I: Chloroform : Ethanol : Nước (4 : 2 : 0,5; lớp dưới)
- Quan sát vết dưới ánh sáng thường, UV 254nm và UV 366nm, hiện màu bằng hơi NH3 đặc.
* Kết quả
- Từ ống 1 đến ống 264: Trên sắc ký đồ có hai vết rõ ở đèn UV254và nhiều vết mờ, gộp các ống thành một phân đoạn, ký hiệu là PĐ1.
- Từ ống 265 trở đi: Trên sắc ký đồ xuất hiện thêm một vết màu vàng rõ ở UV366 tách xa các vết còn lại. Rửa giải cột cho đến khi trên sắc ký đồ dịch rửa