Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

 Nguyên tắc: Chất kháng sinh khuếch tá n vào môi trường dinh dưỡng đặc đã cấy VSV kiểm định, tạo các vùng ức chế VSV gọi là vòng vô khuẩn.

 Tiến hành:

 Tạo hỗn dịch VSV: Lấy 1 vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml môi trường canh thang, để vào tủ 370C trong 18-24h (đối với vi khuẩn).

 Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt khuẩn và để nguội về 45-500C với tỉ lệ 2,5:100 (v:v). Lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng.

 Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định: Có 3 phương pháp:

-Phương pháp khối thạch: Đặt các khối thạch Φ=6,0 mm có VSV sinh kháng sinh lên bề mặt thạch đã cấy VSV kiểm định.

-Phương pháp giếng thạch (dùng cho mẫu dịch lọc nước): Đục các giếng thạch Φ=6,0 mm trên môi trường đã cấy VSV kiểm định , nhỏ 0,05 ml mẫu thử vào mỗi giếng thạch.

-Phương pháp khoanh giấy lọc (dùng cho mẫu dung môi hữu cơ): Đặt các khoanh giấy lọc Φ=6,0 mm đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ và sấy khô lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.

 Các hộp Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm 370

C trong khoảng 18-24h.  Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02 mm. Kết quả được tính theo công thức:

2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n = = − = = − ∑ ∑

D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn, Di: Đường kính vòng vô khuẩn thứ i,

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: Số thí nghiệm làm song song (không có hướng dẫn khác thì n =3) 2.3.3. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

Trong tủ cấy vô trùng, Streptomyces 155.21 được cấy zigzag lên các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn trong hộp Petri, để vào tủ ấm 6 ngày ở 28-300

C. Sau đó thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch . Dựa vào kết quả chọn ra MT cho hoạt tính kháng sinh cao nhất là môi trường nuôi cấy thích hợp (MTth).

2.3.4. Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên

 Pha hỗn dịch bào tử : Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 155.21 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước cất vô trùng.

 Phân tán hỗn dịch bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-5 đến 10-6 nhỏ vào đĩa Petri chứa MTth . Dùng que chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch . Mỗi nồng độ tiến hành trên 3 đĩa. Cho các đĩa đã phân tán bào tử vào tủ ấm.

 Sàng lọc ngẫu nhiên: Sau 6 ngày để trong tủ ấm , các khuẩn lạc xạ khuẩn đã phát triển. Chọn các khuẩn lạc phát triển đa dạng , mọc riêng rẽ cấy zigzag lên đĩa

Petri có môi trường thạch, để vào tủ ấm 6 ngày ở 28-300

C rồi thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch.

2.3.5. Phương pháp đột biến

 Bằng ánh sáng UV:

Pha hỗn dịch bào tử: chuẩn bị như mục 2.3.4. Sau đó hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10-6

, nhỏ vào hộp Petri có môi trường thạch , dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng.

Đột biến bằng ánh sáng UV : 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1 đổ ra đĩa Petri vô trùng . Chiếu ánh sáng UV (λ=254 nm) vào đĩa Petri có hỗn dịch bào tử nồng độ 10-1 đặt cách nguồn sáng 60 cm, trong thời gian 5 phút. Lấy ra để vào chỗ tối 2 giờ, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

.

Phân tán bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử sau đột biến ở các nồng độ 10-4

và 10-5, nhỏ vào hộp Petri có MTth , dàn đều bằng que chang vô trùng rồi cho vào tủ ấm. Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:

% độ sống sót = 0

N Nm

x 10-6+k x 100% Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến.

N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.

-k : Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử sử dụng.

Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sau đột biến , cấy ra hộp Petri . Làm song song cả mẫu chứng. Sau 6 ngày để trong tủ ấm, thử hoạt tính kháng sinh. Tính % biến đổi hoạt tính theo công thức:

% biến đổi hoạt tính = 0

D Di

x 100%

Di: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB. D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.

Sau đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.

 Bằng tác nhân hoá học acid nitrơ (HNO2)

Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2

Pha hỗn dịch bào tử: Chuẩn bị như mục 2.3.5 - pha hỗn dịch bào tử. Đột biến bằng acid nitrơ: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1

cho thêm 0,07g NaNO2. Điều chỉnh pH xuống 4-4,5 bằng dung dịch HCl 0,1N, để yên trong 2-3 phút. Sau đó điều chỉnh pH lên 7-8 bằng dung dịch NaOH 0,1N, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

.

Phân tán bào tử sau đột biến, tính toán kết quả, chọn lọc ngẫu nhiên các biến chủng thực hiện như đột biến bằng ánh sáng UV.

2.3.6. Phương pháp lên men mẻ

 Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 155.21 nuôi cấy trên thạch nghiêng MT phân lập được 6 ngày, được cấy vô trùng sang bình nón 500 ml có 100 ml MT2dt bằng 10 ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28±0,10

C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.

 Chọn môi trường lên men tốt nhất : Sau 48h trên máy lắc , giống cấp 1 được cấy vô trùng sang các bình nón 500 ml chứa các môi trường dịch thể khác nhau với tỉ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10. Các bình lên men lắc ở nhiệt độ 28±0,10

C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120 giờ. Sau đó lọc hoặ c li tâm , rồi thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp giếng thạch.

 Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất : Các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh . Thử hoạt tính dịch lên men bằng phương pháp giếng thạch.

2.3.7. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men men

 Xác định độ bền nhiệt : Lấy 3 ống dịch lọc dịch lên men, mỗi ống khoảng 5- 7ml. Một ống đun sôi trực tiếp 10 phút, một ống đun sôi cách thủy 30 phút, một ống để ở nhiệt độ thường. Đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch.

 Xác định độ bền pH: Lấy 5 ống dịch lọc dịch lên men, mỗi ống khoảng 5 ml. Chỉnh pH dịch lên men trong ống về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 0,1N và HCl 0,1N. Thử hoạt tính dịch trong ống sau 1 ngày, và sau 5 ngày.

2.3.8. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ

Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 0,1N và HCl 0,1N. Dịch lọc và dung môi hữu cơ được cho vào bình gạn với tỷ lệ 5:1 (v:v), lắc 1- 3 phút, để phân lớp 1h sau đó gạn riêng lớp dung môi và lớp nước . Thử hoạt tính của lớp dung môi và lớp nước sau mỗi lần chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc . Có thể chiết một lần hoặc chiết lặp để chiết kiệt được kháng sinh trong dịch lọc.

2.3.9. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký

 Sắc ký lớp mỏng: Chuẩn bị:

-Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1100

C trong 30 phút.

-Dung môi pha đúng theo tỷ lệ , đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1 cm), để bão hòa trong 30 phút.

-Dùng mao quản chấm dịch chiết DMHC hoặc các phân đoạn quá trình sắc ký cột lên bản mỏng , cách mép dưới 1,5 cm, cách 2 mép bên 1 cm. Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, lặp lại 3-5 lần.

Khai triển sắc ký : Đặt bản mỏng vào bình sắc ký , khi dung môi chạy đến ¾ bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.

Hiện sắc đồ : Sấy khô bản mỏng , sau đó soi đèn UV hoặc hiện hình bằng vi sinh vật

-Soi đèn UV : Bản mỏng sắc ký tráng sẵ n đã trộn với một chất phát huỳnh quang khi chiếu ánh sáng UV (thường sử dụng bản mỏng silica gel 60 GF254 hãng Merck). Nên vết chất sẽ tương ứng với vết huỳnh quang sẫm màu.

-Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng , đổ thạch có cấy VSV kiểm định phủ lên, để ở tủ 370

C trong 18-24h. Vết kháng sinh được xác định dựa vào vòng vô khuẩn.

Tính Rf: Rf =

dm v

d d

dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết.

ddm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đường dung môi chạy.  Sắc ký cột:

Chuẩn bị:

-Mẫu thử: Bột KS thô thu được sau cất quay dịch chiết DMHC. -Dung môi: pha đúng theo tỷ lệ.

-Cột: đường kính 1 cm, dài 50 cm, rửa sạch, tráng cồn, sấy khô.

-Chất nhồi cột: Silica gel 60 F254 Merck cỡ hạt 0,06-0,1mm. Cân khoảng 6-8 g hạt, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Hòa thành hỗn dịch với hệ dung môi hữu cơ chạy cho đến khi hết bọt khí rồi đưa lên cột.

-Đưa mẫu thử lên cột : Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, sau đó trộn với khoảng 1-2 g silicagel đã hoạt hóa . Sấy ở 500

C cho bay hết methanol thì cho lên cột đã ổn định cột trong 30 phút.

Chạy cột: Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch (đã tráng cồn để khô), mỗi phân đoạn 5-10 ml.

Xác định phân đoạn chính chứa kháng sinh cần tách:

Thử hoạt tính KS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc . Các phân đoạn có hoạt tính KS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Phân đoạn chính là các phân đoạn có những vết có Rftương đương và có hoạt tính kháng sinh mạnh.

2.3.10. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết

Các phân đoạn chính sau chạy cột được gộp vào bình cầu , cất quay chân không ở nhiệt độ 50 - 600C đến khô , cạo thu bột kháng sinh tinh kh iết vào ống nghiệm sạch. Kết tinh kháng sinh nhiều lần bằng hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp. Lọc, sấy, thu được kháng sinh tinh khiết.

2.3.11. Phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được

Bột KS tinh k hiết đem đi đo các thông số : Nhiệt độ nóng chảy , phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, khối phổ để sơ bộ dự đoán cấu trúc KS thu được.

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1. Kết quả quá trình chọn lọc ngẫu nhiên

 Mục đích: Chọn dạng chủng có hoạt tính KS cao trong quần thể  Kết quả: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên được giới thiệu ở bảng 5:

Bảng 5: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 155.21

Dạng chủng

Hoạt tính kháng sinh (D, s)

Dạng chủng

Hoạt tính kháng sinh (D,s)

P. mirabilis B. subtilis P. mirabilis B. subtilis

D(mm) s D(mm) s D(mm) s D(mm) s 1 24,73 0,69 24,71 1,13 16 21,38 0,24 22,55 1,82 2 23,04 1,48 24,05 1,42 17 21,86 0,70 22,03 1,99 3 23,82 1,59 23,66 0,46 18 22,64 2,07 23,11 1,24 4 23,54 0,08 24,63 0,83 19 22,57 0,93 24,42 1,21 5 22,77 1,63 22,63 0,82 20 22,84 1,17 27,09 1,10 6 23,03 1,68 19,88 0,23 21 21,73 2,44 25,01 1,40 7 21,83 0,88 20,07 0,48 22 22,81 1,62 25,45 0,29 8 26,62 1,52 25,12 0,20 23 21,07 0,81 26,67 0,16 9 21,66 1,56 24,56 0,29 24 22,29 0,32 22,55 1,41 10 24,93 0,64 22,88 1,67 25 21,49 0,35 22,60 1,37 11 23,42 0,47 23,97 0,85 26 22,03 0,35 19,12 0,37 12 25,40 0,82 23,97 0,93 27 24,04 0,41 20,31 0,81 13 24,34 0,88 24,33 0,42 28 21,69 1,79 22,51 0,81 14 21,49 0,95 22,30 0,99 29 21,93 1,17 24,07 0,91 15 23,84 0,67 25,11 1,42 30 21,50 0,98 24,08 0,41

Nhận xét: Các dạng chủng 8, 10, 12 (Ký hiệu: CLNN.8, CLNN.10, CLNN.12) cho hoạt tính KS cao nhất, đồng đều trên cả hai VSV kiểm định được cấy giữ lại để tiến hành đột biến cải tạo giống và dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.

3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1

 Mục đích: Tạo biến chủng có khả năng tăng mạnh tổng hợp KS.

 Chọn chủng CLNN.8 để đột biến bằng ánh sáng UV. Các kết quả chính được trình bày trong bảng 6:

Bảng 6: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 1

Biến chủng

Hoạt tính kháng sinh (D, s) Hoạt tính kháng sinh (D, s)

P. mirabilis B. subtilis D (mm) s % biến đổi hoạt tính D (mm) s % biến đổi hoạt tính 1 22,83 1,31 92 22,29 1,13 93 2 26,84 0,51 108 25,23 0,65 106 3 27,74 0,43 112 25,29 0,35 106 4 23,87 0,24 96 23,26 0,89 106 5 25,14 0,84 101 23,51 1,14 98 6 27,22 0,49 110 25,61 0,60 107 7 23,88 0,48 97 24,79 0,35 1.03 8 19,21 0,37 77 20,99 0,17 88 9 27,69 0,33 121 25,27 0,31 105 10 24,73 0,33 100 24,15 0,55 101 11 27,12 0,37 120 24,94 0,48 105 12 27,21 0,20 110 26,07 0,57 109 13 21,67 0,82 87 23,85 0,45 0.99 14 23,98 0,48 97 24,27 0,06 101 15 27,81 1,07 112 19,49 0,66 ́81 16 23,24 0,75 94 22,98 1,08 96

17 25,91 0,35 105 24,71 0,50 103 18 25,93 0,27 105 22,77 0,22 95 19 20,81 0.4 84 23,37 0,79 95 20 22,86 1,42 92 23,42 0,55 98 21 20,49 0,82 82 24,69 1,12 103 22 24,01 1,05 97 23,87 0,46 96 23 27,21 0,30 110 23,37 0,79 98 24 23,95 0,38 96 24,69 1,12 103 25 25,12 0,39 101 23,87 0,33 100 26 26,93 0,22 109 24,11 0,35 101 27 23,77 0,70 96 22,09 0,51 93 28 25,09 0,20 101 22,84 0,44 95 19 22,65 0,41 105 24,96 0,52 104 30 22,26 0,44 90 20,79 0,46 87 Mẫu 24,69 0,49 100 23,85 0,45 100

Nhận xét: Đột biến lần một có tỷ lệ sống sót là: 1,16%, hoạt tính kháng sinh của chủng CLNN.8 tăng mạnh trên cả P. mirabilis (khoảng 82-121%) và B. subtilis (khoảng 81-109%). Các biến chủng tốt nhất được giữ lại và để đột biến cải tạo giống lần 2 là các biến chủng 3, 9, 12 (ký hiệu ĐB1.3, ĐB1.9, ĐB1.12).

3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2

 Mục đích: Tạo biến chủng có khả năng tổng hợp KS cao hơn.

Chọn biến chủng 3 (ĐB1.3) để đột biến bằng ánh sáng UV. Kết quả chính thể hiện ở bảng 7.

Bảng 7: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 2

Biến chủng

Hoạt tính kháng sinh (D, s) Hoạt tính kháng sinh (D, s)

P. mirabilis B. subtilis D (mm) s % biến đổi hoạt tính D (mm) s % biến đổi hoạt tính 1 27,09 0,25 108 25,09 0,21 104 2 27,65 0,5 110 24,10 0,35 100 3 26,77 0,33 106 24,75 0,50 102 4 19,94 0,43 79 19,55 0,61 81 5 23,92 0,38 95 22,27 1,22 92 6 23,88 0,42 95 23,24 0,17 96 7 24,67 0,60 98 24,14 0,40 100 8 27,05 0,51 107 24,89 0,21 103 9 25,52 0,80 101 24,98 0,26 103 10 27,15 0,31 108 24,68 0,44 102 11 23,90 0,38 95 20,04 0,26 83 12 21,29 0,29 85 20,09 0,23 83 13 27,07 0,45 108 22,93 0,51 95 14 22,82 1,15 91 22,67 0,51 95 15 24,17 0,59 96 23,46 0,64 97 16 24,15 0,15 96 23,08 0,39 96 17 23,17 0,57 92 21,38 0,93 88 18 26,39 0,53 105 24,89 0,20 103 19 22,12 0,73 88 22,32 0,68 92

20 23,64 0,20 94 22,83 1,04 94 21 24,60 0,37 98 23,23 0,70 96 22 22,98 0,46 91 22,99 0,33 95 23 25,67 0,61 103 24,02 0,58 100