2.3.1. Xác định mẫu nghiên cứu.
Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với các khóa phân loại thực vật.
2.3.2. Nghiên cứu định tính các nhóm chất trong dƣợc liệu và trong các cắn n-hexan, ethyl acetat và n-butanol bằng phản ứng hóa học hexan, ethyl acetat và n-butanol bằng phản ứng hóa học
Định tính các nhóm chấtbằng ống nghiệm theo tài liệu Thực tập Dƣợc liệu phần hóa học [1].
2.3.3. Nghiên cứu định tính các nhóm chất trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng sắc kí lớp mỏng
Định tính các cắn phân đoạn theo tài liệu Thực tập Dƣợc liệu phần hóa học [1].
2.3.4. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các chất
Chiết hoạt chất từ dƣợc liệu bằng ethanol 96% theo phƣơng pháp chiết nóng. Cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm. Phân đoạn dịch chiết bằng dung môi công nghiệp có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat và n-butanol.
Sử dụng sắc ký cột với các chất hấp phụ silica gel pha thƣờng, pha đảo, Sephadex để phân lập các chất. Khảo sát nhiều hệ dung môi pha động khác nhau để lựa chọn điều kiện tối ƣu. Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn.
Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (soi dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc
2.3.5 Phƣơng pháp thử độc tính cấp
2.3.5.1. Xác định hàm ẩm của dược liệu và cao sâm cau
Cân chính xác khoảng 2 g bột thân rễ sâm cau vào cốc (cốc đã xác định khối lƣợng), sấy ở 105oC áp suất thƣờng trong 3 giờ. Sau đó lấy cốc ra, làm nguội tới nhiệt độ phòng bằng cách cho vào bình hút ẩm 15 phút, rồi cân ngay.
Làm lại nhiều lần đến khối lƣợng không đổi [2]. Độ ẩm dƣợc liệu tính theo công thức:
X= x 100%
Trong đó:
X: hàm ẩm dƣợc liệu. tính ra phần trăm a: khối lƣợng dƣợc liệu khi chƣa sấy
b: khối lƣợng dƣợc liệu sau sấy đến khối lƣợng không đổi. Làm tƣơng tự đối với cao dƣợc liệu.
2.3.5.2.Động vật làm thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng Swiss albino cả 2 giống, có trọng lƣợng 18-22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.
2.3.5.3. Phương pháp nghiên cứu [8], [13].
- Chuột mua về đƣợc nuôi 5 ngày trƣớc khi thí nghiệm để chuột thích nghi điều kiện thí nghiệm. Cho chuột nhịn đói 16 giờ và uống nƣớc tự do theo nhu cầu. Chiachuột thành các lô thí nghiệm, mỗi lô 10 chuột.
- Đƣờng dùng thuốc: đƣờng uống, cho chuột uống bằng cách dùng bơm tiêm
có kim đầu tù để đƣa mẫu thử vào dạ dày chuột một cách nhẹ nhàng.
- Chuẩn bị mẫu thử: Cao chiết đƣợc thêm nƣớc cất, nghiền đều tạo dung dịch
có nhiều nồng độ khác nhau có thể cho chuột uống đƣợc.
- Tìm liều tối đa mà không có chuột nào của lô thí nghiệm chết (LD0) và liều tối
thiểu để 100% chuột của lô thí nghiệm chết (LD100). Nếu có chuột chết thì thử thêm
-Thời gian theo dõi: Chuột đƣợc theo dõi và quan sát các biểu hiện về hành vi, hoạt động, ăn uống, bài tiết, đếm số chuột sống chết trong vòng 72 giờ (nếu có).
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
3.1.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân rễ sâm cau bằng phản ứng hóa học
Chuẩn bị dịch chiết nước: Cho 2 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 50 ml,
thêm 15 ml nƣớc cất, đun sôi trực tiếp trên bếp điện 5 phút, lọc qua giấy lọc gấp nếp làm các phản ứng
Chuẩn bị dịch chiết ethanol: Cho 9 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 100
ml, thêm 80 ml EtOH 90o , đun cách thủy 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp, làm các phản ứng
Chuẩn bị dịch chiết Ether dầu hỏa: cho 5g dƣợc liệu vào bình nón dung tích 50
ml, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm. Dịch lọc làm các phản ứng.
Tiến hành làm 3 mỗi thí nghiệm 3 lần.
3.1.1.1. Định tính alcaloid
Lấy 5g dƣợc liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml dung dịch H2SO4 1N,
để ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi đun sôi cách thủy 30 phút. Dịch chiết lọc qua giấy lọc vào bình gạn. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch ammoniac đặc. Chiết alcaloid bằng chloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml. Dịch chiết chloroform gộp lại và acid hóa
bằng H2SO4 1N. Gạn lấy lớp nƣớc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml rồi
thêm vào:
Ống 1: 2-3 giọt TT Mayer, thấy xuất hiện ít tủa bông trắng Ống 2: 2-3 giọt TT Dragendorff, thấy xuất hiện ít tủa da cam.
Kết luận: Dƣợc liệu có chứa alcaloid
3.1.1.2. Định tính glycoside tim
Cho 10 g bột dƣợc liệu vào bình nón có dung tích 100 ml, thêm 80 ml EtOH 70o.
Ngâm trong 24 giờ, gạn dịch chiết vào cốc cỏ mỏ, loại tạp bằng chì acetat 30%. Lọc bỏ tủa. Dịch lọc sau khi bay hơi hết cồn cho vào bình gạn lắc kĩ 3 lần với chloroform, mỗi lần 15 ml. Gạn dịch chloroform vào cốc có mỏ, bay hơi dung môi.
Phản ứng Liberman-Bouchardat: Cô cạn cách thủy, hòa tan cắn trong 1 ml
anhydrit acetic. Đặt nghiêng ống nghiệm thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống
nghiệm, không thấy xuất hiện màu nâu giữa 2 mặt phân cách
Phản ứng Baljet: thêm 0,5 ml TT Baljet (1 phần acid picric 1% trong cồn và 9 phần NaOH 10%) không thấy xuất hiện đỏ cam
Phản ứng Legal: thêm 5 giọt Natri nitroprussiat và thêm từ từ vài giọt NaOH 10% (đảm bảo kiềm dƣ) không thấy xuất hiện màu đỏ.
Kết luận: dƣợc liệu không có glycosid tim
3.1.1.3. Định tính phytosterol
Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dƣợc liệu, thêm 10 ml chloroform, ngâm ở nhiệt độ phòng 60 phút. Lọc dịch chiết, bay hơi dung môi. Hòa tan cắn bằng 0,5ml anhydrit acetic, lắc đều. Đặt nghiêng ống nghiệm 45o, cho thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có màu đỏ.
Kết luận: Dƣợc liệu có phytosterol
3.1.1.4. Định tính tanin
Lấy dịch chiết nƣớc chia vào mỗi ống nghiệm 1 ml
Phản ứng với TT FeCl3 5%: thêm vào ống nghiệm vài giọt TT FeCl3 5% thấy xuất hiện màu xanh rêu
Phản ứng với Gelatin 1%: thêm vào ống nghiệm vài giọt Gelatin 1%: không thấy xuất hiện tủa bông trắng
Kết luận: Dƣợc liệu không có tanin
3.1.1.5. Định tính acid hữu cơ
Thêm vào dịch chiết nƣớc ít bột Natri carbonat không thấy xuất hiện bọt khí
Kết luận: Dƣợc liệu không có acid hữu cơ
3.1.1.6. Định tính đường khử tự do
Thêm vào dịch chiết nƣớc 2 giọt TT Fehling A và 2 giọt TT Fehling B, đun cách thủy xuất hiện tủa đỏ gạch
3.1.1.7. Định tính saponin
Quan sát hiện tƣợng tạo bọt:
Lấy 1 ml dịch chiết nƣớc, thêm 5ml nƣớc lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm, để yên quan sát. Thấy có bọt và bền trong 15 phút
Phản ứng Salkowski
Cho 1ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm. Thêm 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống
nghiệm, thấy xuất hiện vòng nâu đỏ ở mặt phân cách 2 lớp chất lỏng
Kết luận: Dƣợc liệu chứa saponin
3.1.1.8. Định tính acid amin
Thêm vài giọt TT Ninhydrin 2% trong aceton vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch chiết ethanol: không thấy xuất hiện màu tím sẫm
Kết luận: Dƣợc liệu không có acid amin
3.1.1.9. Định tính coumarin
- Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết ethanol Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%
Ống 2 để nguyên
Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm đến sôi thấy: Ống 1: xuất hiện màu vàng hơn
Ống 2: trong
Thêm vào cả 2 ống, mỗi ống 1 ml nƣớc cất, lắc đều thấy: Ống 1: Dung dịch vẫn có màu vàng
Ống 2: Dung dịch trong
Thêm vào ống 1 vài giọt dung dịch HCl đặc thấy cả 2 ống nghiệm đều trong suốt, không có tủa đục.
Phản ứng với TT Diazo:
Cho 1 ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm vài giọt NaOH 10% vào, sau đó thêm vài giọt TT Diazo, không thấy xuất hiện màu đỏ sẫm.
3.1.1.10. Định tính flavonoid
Chia dịch chiết ethanol vào mỗi ống nghiệm 1 ml làm phản ứng
Phản ứng với kiềm: Thêm vài giọt NaOH 10% vào thấy xuất hiện tủa vàng Phản ứng với FeCl3 : Thêm vài giọt FeCl3 vào thấy xuất hiện tủa đen.
Phản ứng Cyanidin: Thêm ít bột Mg kim loại và vài giọt dung dịch HCl đặc vào, đun cách thủy, không thấy dung dịch chuyển sang màu đỏ.
Kết luận: Dƣợc liệu không có flavonoid nhƣng có hợp chất phenolic
3.1.1.11. Định tính caroten
Sử dụng dịch chiết ether làm phản ứng.
Lấy 5 ml dịch lọc vào ống nghiệm, cô tới cắn, thêm vào cắn 2 giọt H2SO4 đặc, thất xuất hiện màu xanh nâu.
Kết luận sơ bộ: Dƣợc liệu có caroten.
3.1.1.12. Định tính chất béo
Nhỏ 2-3 giọt dịch chiết ether lên giấy lọc, hơ khô, thấy để lại vết mờ
Kết luận: Dƣợc liệu chứa chất béo.
Nhận xét:Qua các phản ứng hóa học trên, chúng tôi đƣa ra kết luận sơ bộ trong dƣợc liệu thân rễ sâm cau có chứa: saponin, alcaloid, phytosterol, đƣờng khử tự do, chất béo, carotene và hợp chất phenolic.
Kết quả nghiên cứu trên trùng khớp với đề tàicủa Nguyễn Duy Thuần và Nguyễn Thị Phƣơng Lan (2001)[11]. Ngoài ra, thân rễ của cây sâm cau đƣợc thu
hái tại Cao Bằng và Đắc Lắc có chứa thành phần alkaloid, tuy nhiên hàm lƣợng còn
ít.
Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất có trong thân rễ sâm cau bằng phản ứng hóa học
Hợp chất Các phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1. Phytosterol Phản ứng với anhydrit acetic và
H2SO4 đặc
+++
Có
2. Alcaloid Với TT Dragendorff
Với TT Mayer
+
+ Có
3. Acid amin Với TT Ninhydrin 1% trong
aceton - Không 4. Saponin Tạo bọt Phản ứng Salkowski + ++ Có 5. Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton
Phản ứng với thuốc thử Diazo
-
- Không
6. Flavonoid Với NaOH
Với FeCl3 Với Cyanidin ++ +++ - Không
7. Glycosid tim Phản ứng Liberman-Boucharrdat
Phản ứng Baljet Phản ứng Legal - - - Không
8. Tanin Với FeCl3
Với Gelatin 1%
++ -
Không
9. Acid hữu cơ Với Na2CO3 - Không
10.Đƣờng khử Với TT Fehling A và B +++ Có
11.Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc ++ Có
12.Chất béo Phản ứng mờ giấy lọc + Có
Ghi chú: (-): phản ứng âm tính. (++) dƣơng tính rõ. (+) phản ứng dƣơng tính. (+++) dƣơng tính rất rõ.
3.1.2. Định tính các nhóm chất trong các cắn phân đoạn của thân rễ sâm cau bằng phản ứng hóa học
Quá trình chiết xuất
Dƣợc liệu 3,6 kg thân rễ sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) độ ẩm 10,5
% đƣợc cắt nhỏ, chiết nóng với ethanol 96% ở nhiệt độ 650
C (chiết 3 lần, mỗi lần 4 giờ). Dịch chiết đƣợc gộp lại và cất loại cồn nƣớc dƣới áp suất giảm thu đƣợc cắn chiết cồn đã cô khô (540 g).
Hình 2: Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn các chất từ thân rễ sâm cau
Cắn chiết đƣợc hòa tan vào nƣớc cất (0,5 lít) thành hỗn dịch rồi lắc, chiết phân đoạn lần lƣợt với n-hexan (0,5 lít × 3 lần), ethyl acetat (0,5 lít × 3 lần), n-
butanol (0,5 lít × 3 lần). Các dịch chiết n-hexan, ethyl acetat và n-butanol đƣợc tách riêng, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các phần cắn tƣơng ứng: cắn
phân đoạn n-hexan (cắn H - 48 g), cắn phân đoạn ethyl acetat (cắn E - 55 g) và cắn
phân đoạn n-butanol (cắn B - 105 g).
Lấy cắn các phân đoạn: n-hexan, ethyl acetat và n-butanol làm các phản ứng hóa học. Kết quả thể hiện qua bảng 2.
Bảng 2: Kết quả định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học
Nhóm chất Các phản ứng định tính Cắn n- hexan Cắn ethyl acetat Cắn n- butanol
1. Flavonoid Với NaOH 10%
Với FeCl3 5% Phản ứng Cyanidin ++ +++ - +++ +++ - +++ +++ -
2. Tanin Với FeCl3 5%
Với Chì acetat 10% Với gelatin 1% ++ + - +++ + - +++ - - 3. Saponin Tạo bọt Phản ứng Salkowski + ++ + ++ + +++
4. Đƣờng khử Với TT Fehling A+B ++ ++ +++
5. Chất béo Vết mờ giấy lọc + + -
6. Carotene Với H2SO4 đặc + + -
Ghi chú: (-) phản ứng âm tính. (++) dƣơng tính rõ. (+) phản ứng dƣơng tính. (+++) dƣơng tính rất rõ.
Sơ bộ kết luận:
Cắn n-hexan có: chất béo, caroten, saponin, đƣờng khử, hợp chất phenolic.
Cắn ethyl acetat có: chất béo, caroten, saponin, đƣờng khử, hợp chất phenolic.
3.1.3. Kết quả định tính nhóm chất hữu cơ trong thân rễ sâm cau bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng
Chuẩn bị:
Bản mỏng: Silicagel 60F254 tráng sẵn, đƣợc hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ. Bão
hòa dung mội trong 1 giờ
Dung dịch chấm sắc kí: Cắn n-hexan, cắn ethyl acetat và cắn n-butanol hòa tan
trong methanol.
Quan sát sắc kí đồ thu đƣợc sau khi triển khai với hệ dung môi thích hợp dƣới ánh sáng tử ngoại ở 2 bƣớc sóng UV 254 nm, UV 366 nm và ánh sáng thƣờng,
TT hiện màu là dung dịch acid sulfuric 10%, sấy ở 100oC trong 10 phút.
3.1.3.1. Định tính phân đoạn dịch chiết n-hexan bằng sắc kí lớp mỏng
Tiến hành khảo sát trên nhiều hệ dung môi khác nhau: Hệ I: Chloroform: methanol: nƣớc = 65:35:10
Hệ II: Toluen: ethyl acetat: aceton: axit formic = 5:2:2:1
Hệ III: n-hexan: ethyl acetat= 1:3
Qua đó nhận thấy hệ III tách tốt nhất, các vết tách nhau rõ rảng, kết quả đƣợc thể hiện qua hình ảnh sắc kí đồ hình 3.
Chú thích: A: Không phun TT, quan sát ở UV 254nm
B và D: quan sát ở UV 366 nm trƣớc và sau khi phun TT C: quan sát ở ánh sáng thƣờng sau khi phun TT
Nhận xét: Trên hình ảnh sắc kí đồ của phân đoạn n-hexan
Khi chƣa phun TT và quan sát ở UV 254 nm thấy có những vết màu đen trên nền sáng.
Quan sát ở UV 366 nm khi chƣa phun TT: có những vết phát quang màu xanh
Sau khi phun TT, quan sát ở ánh sáng thƣờng có 8 vết rõ nét với Rf tƣơng ứng
trong bảng 3.
Bảng 3: Bảng giá trị Rf của các vết ở phân đoạn n-hexan
STT 1 2 3 4 5 6 7 8
Rf 0,036 0,272 0,336 0,4 0,7 0,745 0,8 0,863
3.1.3.2. Định tính phân đoạn dịch chiết ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng.
Tiến hành khảo sát trên nhiều hệ dung môi khác nhau: Hệ I: Toluen: ethyl acetat: aceton: axit formic = 5:2:2:1
Hệ II: Chloroform: methanol: nƣớc= 65:35:10
Hệ III: Chloroform: methanol = 3:1
Qua đó nhận thấy hệ II tách tốt nhất, các vết tách nhau rõ ràng nhất, kết quả đƣợc thể hiện qua hình ảnh sắc kí đồ hình 4.
Hình 4: Sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng định tính cắn phân đoạn ethyl acetat với hệ II
Chú thích: A: Không phun TT, quan sát ở UV 254 nm
B và D: quan sát ở UV 366 nm trƣớc và sau khi phun TT C: quan sát ở ánh sáng thƣờng sau khi phun TT
Nhận xét: Trên hình ảnh sắc kí đồ phân đoạn ethyl acetat:
Khi chƣa phun TT, quan sát ở UV 254 nm, thấy có 2 vết đen đậm trên nền sáng Sau khi phun TT và quan sát ánh sáng thƣờng, thấy sắc kí đồ có 4 vết chính đậm
màu với Rf tƣơng ứng trong bảng 4.
Bảng 4: Bảng giá trị Rf của các vết ở phân đoạn ethyl acetat
STT 1 2 3 4
Rf 0,306 0,0,357 0,536 0,528
3.1.3.3. Định tính phân đoạn dịch chiết n-butanol bằng sắc kí lớp mỏng.
Tiến khảo sát trên các hệ dung môi khác nhau: Hệ I: Chloroform: methanol: nƣớc= 65:35:10 Hệ II : Chloroform: ethanol: axit acetic= 60: 40:5
Qua đó nhận thấy hệ III tách tốt nhất, các vết tách nhau rõ ràng nhất, kết quả đƣợc thể hiện qua hình ảnh sắc kí đồ hình 5.
Hình 5: Sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng định tính cắn phân đoạn n-butanol với hệ III
Chú thích: A và C quan sát ở UV 366 nm trƣớc và sau khi phun TT