Cắn phân đoạn n-hexan ( 48 g) đƣợc chạy qua cột sắc ký silicagel pha thƣờng (200 g silicagel, cột có đƣờng kính 10 cm; chiều dài 1m), rửa giải bằng hệ dung môi ban đầu làhexan/ethyl acetat (20/1) và tỷ lệ ethyl acetat tăng dần. Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng, thu đƣợc 8 phân đoạn chính (H1-H8).
Phân đoạn H4 (5,4 g) đƣợc đƣa lên cột sắc ký silicagel pha thƣờng( 100g silicagel pha thƣờng, cột có đƣờng kính 4 cm, chiều dài 80 cm), rửa giải bằng hệ dung môi ban đầu là hexan/ethyl acetat (10/1) và tỉ lệ ethyl acetat tăng dần. Kiểm
tra phần dịch rửa bằng sắc kí lớp mỏng thu đc 9 phân đoạn chính (H4.1- H4.9)
Phân đoạn H4.5 (0,83 g) đƣợc rửa giải nhiều lần bằng methanol thu đƣợc chất rắn màu trắng, kí hiệu SC1.
Hình 8: Quy trình phân lập hợp chất SC1 từ cắn n-hexan của thân rễ sâm cau
Bằng triển khai sắc kí lớp mỏng, hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (3:1) thu đƣợc hình ảnh sắc kí đồ sau:
Hình 9: Sắc kí đồ định tính sự có mặt của SC1 phân lập đƣợc trong cắn phân đoạn n-hexan và hợp chất β - sitosterol chuẩn
Chú thích:
A: Không phun TT, quan sát ở UV 254nm
B và D: quan sát ở UV 366 nm trƣớc và sau khi phun TT O: quan sát ở ánh sáng thƣờng sau khi phun TT
Nhận xét:
Khi quan sát ở UV 366 nm không thấy chất X và chất chuẩn phát quang
Tuy nhiên sau khi phun TT và quan sát dƣới ánh sáng thƣờng thì thấy vết chất chuẩn và chất X có màu tím hồng, sau đó chuyển sang tím đậm hơn. Hợp chất SC1 có màu sắc và Rf trùng với hợp chất β -sitosterol chuẩn, một hợp chất đã đƣợc tìm thấy trong loài Curculigo orchioides Gaertn. [59].
Hình 10: Công thức cấu tạo hợp chất SC1 β-sitosterol 3.2.2. Trong phân đoạn ethyl acetat
Cắn phân đoạn ethyl acetat (55 g) đƣợc chạy qua cột sắc ký silicagel pha thƣờng(200 g silicagel, cột có đƣờng kính 10 cm; chiều dài 1m), rửa giải bằng hệ dung môidicloromethan/methanol (D/M) với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0% đến 100 %. Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng, thu đƣợc 10 phân đoạn chính (E1-E10).
Phân đoạn E6 (2,3 g) đƣợc đƣa lên cột sephadex (100 g hạt sephadex LH-20,
cột có đƣờng kính 3 cm; chiều dài 80 cm) rửa giải bằng methanol thu đƣợc 4 phân đoạn E6.1 đến E6.4.
Phân đoạn E6.2 (0,638 g) tiếp tục đƣợc phân tách bằng cột silicagel pha đảo
RP18 (50 g silicagel pha đảo, cột có đƣờng kính 2 cm; chiều dài 80 cm) sử dụng hệ
dung môi MeOH/H2O (1/2) thu đƣợc chất số 2 (ký hiệu SC2; 38 mg).
H: Cắn n-hexan X: SC1
Hình 11: Quy trình phân lập hợp chất SC2 từ cắnethyl acetat của thân rễ sâm cau
Tiến hành chạy sắc kí lớp mỏng với cắn ethyl acetat và SC2 bằng hệ dung môi D:M (6:1), phun TT acid trong cồn và quan sát ở ánh sáng thƣờng và UV 366 nm, thể hiện qua sắc kí đồ hình 12.
Hình 12: Sắc kí đồ định tính sự có mặt của SC2 phân lập đƣợc trong cắn phân đoạn ethyl acetat
Chú thích:
A: sắc kí đồ sau khi phun TT quan sát ở ánh sáng thƣờng B: sắc kí đồ sau khi phun TT quan sát UV 366 nm. E: cắn ethyl acetat
C: SC2
Nhận xét : Quan sát ở ánh sáng thƣờng và UV 366 nm thì đều thấy Rf của
SC2 trùng với 1 vết trong cắn ethyl acetat.
Xác định cấu trúc của hợp chất SC2
Hợp chất SC2: Bột màu trắng. Phổ IR (cm-1): 3404, 2920, 1618, 1461, 1182,
1078. Phổ ESI-MS (m/z) =287 [M+H]+. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-
Bảng 6: Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chấtSC2 Vị trí SC2a Hợp chất Orcinol-3-O-β-D- glucosida [82] δH (số H; độ bội; J=Hz) ppm δC (ppm) δH ( số H, độ bội, J=Hz) ppm δC (ppm) 1 160,1 160,0 2 6,44 (1H, s) 102,2 6,33 (1H, s) 102,2 3 159,3 159,1 4 6,38 (1H, t, 2,0) 109,7 6,29 (3H, s) 109,8 5 141,2 141,2 6 6,31 (1H, s) 111,2 6,21 (3H, s) 111,2 1’ 4,87 (1H, d, 7,5) 102,2 4,76 (1H, d, 6,8) 102,1 2’ 3,38-3,92 (6H, m) 74,9 3,33-3,80 (6H, m) 74,8 3’ 78,0 77,9 4’ 71,4 71,3 5’ 78,1 77,9 6’ 62,5 62,4 CH3 2,24 (3H, s) 21,7 2,12 (3H, s) 21,7
Hợp chất SC2 phân lập đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ IR
cho biết trong phân tử của SC2 có các nhóm chức: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh
3404 cm-1), liên kết đôi C=C nhân thơm (1618; 1461 cm-1) và liên kết C-O (1182;
1078 cm-1). Phổ 1H-NMR cho biết hợp chất SC2 có ba proton của nhân thơm xuất
hiện ở độ chuyển dịch lần lƣợt là δH6,44; 6,38; 6,31 ppm, một nhóm các tín hiệu ở
độ chuyển dịch từ 3,38-4,87 ppm, một tín hiệu singlet của nhóm methyl ở δH2,24
ppm. Phổ 13C-NMR và DEPT của SC2 cho biết có 13 tín hiệu carbon, trong đó 6 tín
hiệu liên kết đôi C=C của vòng thơm có độ chuyển dịch δC từ 102,2 đến 160,1 ppm.
Dựa vào việc phân tích các dữ kiện phổ, chúng tôi xác định hợp chất SC2 là một phenolic glycosid, một nhóm hợp chất chính có trong loài sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) [56],[35]. Tiếp tục, các dữ kiện phổ NMR cho thấy, cấu trúc của
SC2 có một vòng thơm với ba nhóm thế (do trên phổ 1H-NMR chỉ xuất hiện tín
hiệu của 3 proton thơm). Nhóm thế thứ nhất đƣợc xác định là nhóm thế CH3. Nhóm
tử của hợp chất SC2 đƣợc xác định qua tín hiệu proton anomer (H-1’) xuất hiện dƣới dạng doublet với hằng số ghép cặp J=7,5 Hz ở δH=4,87 ppm và tín hiệu của nhóm CH2 (C-6’) ở δC=62,5 ppm [44]. Nhóm thế thứ ba đƣợc khẳng định là nhóm hydroxy (OH) thông qua phổ khối. Phổ khối của hợp chất SC2 có pic ion ở m/z
=287 [M+H]+ cho biết công thức phân tử là (C13H18O7, M=286). Do đó, chúng tôi
xác định hợp chất SC2 là hợp chất Orcinol-3-O-β-D-glucosid, và đƣợc khẳng định
sau khi tham khảo các tài liệu [44], [82]. Hợp chất SC2 đã đƣợc tìm thấy trong một
số loài thuộc chi Curculigo[56], [82]và sự có mặt của nó trong loài Curculigo orchioides ở Ấn Độ cũng đã đƣợc Gupta và các cộng sự công bố [35]. Đây là lần đầu tiên hợp chất này đƣợc phân lập từ cây sâm cau thu hái ở Việt Nam.
Hình 13: Công thức cấu tạo SC2 Orcinol-3-O-β-D-glucosid
3.3. THỬ ĐỘC TÍNH CẤP
3.3.1. Kết quả xác định hàm ẩm dƣợc liệu và cao dƣợc liệu
Theo [2] kết quả hàm ẩm dƣợc liệu thu đƣợc thể hiện ở bảng sau
Bảng 7: Kết quả xác định hàm ẩm thân rễ sâm cau
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
mtrƣớc (g) 2,6069 2,6143 2,6154
msau (g) 2,3748 2,3953 2,4007
Hàm ẩm (%) 8,90 8,38 8,21 8,49
Bảng 8: Kết quả xác định hàm ẩm của cao thân rễ sâm cau
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
mtrƣớc (g) 3,4908 3,4503 3,4646
msau (g) 2,7602 2,7305 2,7419
Hiệu suất chiết là:
X= x 100% = 12,96%
3.3.2. Kết quả thí nghiệm
Lô chuột đầu tiên đƣợc cho uống ở liều tƣơng đƣơng 10,0 g cao/kg thể trọng chuột. Sau khi uống chuột vẫn hoạt động bình thƣờng, không thấy có biểu hiện khác lạ về hành vi cũng nhƣ ăn uống. Sau 72 giờ theo dõi, tất cả các chuột của lô thí nghiệm đều sống, khỏe mạnh.
Lô chuột thứ hai đƣợc cho uống với liều tăng gấp 2 lần liều ban đầu tức 20,0 g cao/kg thể trọng chuột. Sau khi uống, chuột vẫn hoạt động bình thƣờng, không thấy có biểu hiện khác lạ về hành vi cũng nhƣ ăn uống. Sau 72 giờ theo dõi, tất cả các chuột của lô thí nghiệm đều sống, khỏe mạnh.
Lô chuột thứ ba đƣợc cho uống với liều tăng gấp 3 lần liều đầu tiên tức 30,0g/kg thể trọng chuột. Sau khi uống chuột vẫn hoạt động bình thƣờng, không thấy có biểu hiện khác lạ về hành vi, tuy nhiên chuột ăn và uống ít hơn bình thƣờng, phân có màu đen và ƣớt của cao. Sau 24 giờ uống cao chiết thì thấy chuột trở lại ăn uống bình thƣờng. Sau 72 giờ theo dõi, tất cả các chuột của lô thí nghiệm đều sống khỏe manh.
Lô chuột thứ tƣ đƣợc cho uống với liều tối đa có thể cho chuột uống (dung dịch đặc nhất, thể tích tối đa có thể đƣa vào dạ dày chuột) là 45,0g cao/kg thể trẹng chuột. Sau khi uống thì chuột vẫn hoạt động bình thƣờng, không có biểu hiện khác lạ về hành vi, ăn và uống rất ít. Sau khoảng 6 giờ uống mẫu thử thì phân có màu đen và ƣớt của cao. Sau 24 giờ uống thì mẫu chuột ăn uống trở lại bình thƣờng. Sau 72 giờ theo dõi, tất cả chuột của lô thí nghiệm đều sống khỏe mạnh. Đây là liều tối đa có thể cho chuột uống mà chuột vẫn không chết nên thí nghiệm đƣợc dừng lại. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng 9.
Bảng 9: Số liệu thử độc tính cấp của cao chiết ethanol sâm cau
Lô thí nghiệm Liều uống (g /kg) Số chuột/lô Số chuột chết
1 10 10 0
2 20 10 0
3 40 10 0
4 45 10 0
Liều tối đa cho chuột uống là 45 g cao/kg tƣơng đƣơng 347 g dƣợc liệu/kg chuột., tƣơng đƣơng 34,7 g dƣợc liệu/kg ở ngƣời (tính theo hệ số 10)
Theo tài liệu tham khảo [56], liều dùng trong dân gian của sâm cau là 3-9 g dƣợc liệu/ngƣời/ngày. Giả sử ngƣời trƣởng thành có trọng lƣợng 50 kg thì liều này tƣơng đƣơng 0,06-0,18 g dƣợc liệu/kg/ngày, thì so với liều (34,7 g) gấp khoảng 200 lần vẫn chƣa gây độc[8].
BÀN LUẬN
VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Kết quả định tính bằng sắc kí lớp mỏng trong cắn phân đoạn thân rễ sâm cau: Trên hình ảnh sắc kí đồ của các cắn n-hexan có 8 vết rõ nét, cắn ethyl acetat có 4 vết rõ nét và cắn n-butanol có 3 vết rõ nét khi quan sát ở ánh sáng thƣờng sau
khi phun TT. Tuy nhiên số vết trên sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng của cắn n-butanol còn
ít, dƣới chân bản mỏng có vết đen bị kéo dải, đây có thể là những hợp chất polysaccharide. Dựa trên cơ sở đó tiếp tục thực hiện các hƣớng nghiên cứu tiếp theo, chiết xuất và phân lập các chất trong các phân đoạn này.
Ngoài những hợp chất đã đƣợc nghiên cứu trƣớc đây trong đề tài của Nguyễn Duy Thuần và Nguyễn Thị Phƣơng Lan (2001) [15], đặc biệt thân rễ sâm cau thu hái tại Đắc Lắc và Cao Bằng có thêm thành phần alcaloid, tuy nhiên hàm lƣợng ít, cần tiếp tục nghiên cứu thêm.
VỀ CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC
Hợp chất 1 :β-sitosterol
Sitosterollà một hợp chất đƣợc phân lập và xác định là có hàm lƣợng caotrong nhiều loài thực vật. Lƣợng sitosterol tinh chế có trong các loài thực vật nhƣ sau: dầu oliu chứa tới 2,21%-2,36%; dầu đậu nành chứa tới 1,23%-1,73%; hoa hƣớng dƣơng có tới 4,65%, cám gạo cũng chứa tới 5,71%; hạt bông có 3.03%-3,43%; hạt cải có 1,38%-3,73%...[71].
Trên thế giới hợp chấtβ-sitosterol cũng đã đƣợc chiết xuất và phân lập từ cây sâm
cau [59], với với nhiều hƣớng nghiên cứu tác dụng khác nhau: Tác dụng giảm cholesterol máu [57], [60].
Có tác dụng chống một số loại ung thƣ nhƣ ung thƣ vú, đại tràng và tinh hoàn bằng cách ức chế sự phân chia tế bào ung thƣ và kích hoạt apoptosis. Imanaka
và cộng sự cũng đã nghiên cứu bào chế liposom β-sitosterol để ngăn chặn ung thƣ
di căn ở chuột. Ngoài ra nó còn kích thích hệ miễn dịch ở đƣờng tiêu hóa, kích hoạt các tế bào giết tự nhiên và sinh ra các cytokine miễn dịch [37].
Tác dụng chống oxy hóa. Nghiên cứu của Li và cộng sự chỉ ra rằng “sitosterol có hoạt tính bảo vệ khỏi phóng xạ bằng cách điều hòa các enzym redox nội bào, do đó tiêu diệt gốc tự do và duy trì tính bền vững của màng ti thể” [45].
Có tác dụng với bênh nhân phì đại tuyến tiền liệt do chúng làm tăng tốc độ dòng chảy nƣớc tiểu ở các bệnh nhân này [22].
Các tác dụng dƣợc lý trên cũng đã đƣợc sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền Ấn Độ để điều trị rối loạn niệu nhƣ tiểu khó, tiểu ra máu [16],[28]. Tại Việt Nam, cây Sâm cau đƣợc thƣờng dùng chữa ngƣời già đái són [9],[16],[6]... Trong đó có một bài thuốc là chữa huyết áp cao nhất là phụ nữ ở thời kì mãn kinh [16]. Tuy nhiên vẫn chƣa có nhiều bài thuốc hƣớng đến công dụng chống ung thƣ, chống oxy hóa và chống ung thƣ. Vì vậy có thể mở ra nhiều hƣớng nghiên cứu sâu hơn về tác dụng của hợp chất β-sitosterol phân lập đƣợc từ cây sâm cau.
Hợp chất 2 :Orcinol-3-O-β-D-gulcosidlà một hợp chất phenolicglycosid chính trong cây.Các nghiên cứu trên thế giới công bố đã chỉ ra rằng hợp chất Orcinol-3-O-β-D-gulcosid có tác dụng chống oxy hóa [19], [74]; điều hòa miễn dịch[20], [42] và chống loãng xƣơng [24].Đồng thời nghiên cứucủa Nguyễn Duy Thuần và Nguyễn Thị Phƣơng Lan (2011)cũng đã chỉ ra khả năng chống oxy hóa của dƣợc liệu khá cao (66,25%) [15].
Ngoài ra nó còn có tác dụng bảo vệ các tế bào cơ quan nội tạng khi chúng trị liệu bởi các thuốc và tác nhân hóa học [47].
Từ xƣa đến nay đã có nhiều bài thuốc cổ truyền đƣợc dân gian sử nhƣ: Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ thân rễ sâm cau ép lấy nƣớc có tác dụng chống nhiễm trùng, làm lành vết thƣơng [28], [56]. Tại Philippin, thân rễ giã nát đắp trên da để trị ngứa [56].
Qua các tài liệu đã công bố ở trong nƣớc đã cho thấy, mặc dù theo kinh nghiệm dân gian sâm cau đã đƣợc dùng để làm thuốc nhƣ chữa nam giới tinh lạnh, liệt dƣơng,thần kinh suy nhƣợc; phong thấp, lƣng gối lạnh đau… nhƣng cho đến nay ở Việt Nam còn rất ít các bài thuốc hƣớng đến tác dụng chống oxy hóa, chống loãng xƣơng, điều hòa miễn dịch và bảo vệ tế bào từ dƣợc liệu sâm cau.
VỀ ĐỘC TÍNH CẤP
Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi đƣa ra kết quả liều tối đa cho chuột uống là 45 g cao/kg tƣơng đƣơng 347 g dƣợc liệu/kg chuộtthì so với liều (34,7 g tính theo hệ số 10) gấp khoảng 200 lần vẫn chƣa gây độc. Nhƣ vậy theo Đỗ Trung Đàm thì cao chiết ethanol của sâm cau là an toàn, không gây độc tính cấp, có thể sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền[8], [56].
Theo Nie Y. thông thƣờng khi uống sâm cau ở liều khuyến cáo không gây ra bất kỳ tác dụng phụ hay độc tính nào, tuy nhiên nếu uống nhiều trong khoảng thời gian dài có thể xuất hiện một số tác dụng nhƣ ra mồ hôi lạnh, tê cóng chân tay. Vì vậy, chỉ sử dụng ở mức liều mà đã chắc chắn tính an toàn của chế phẩm [56].
Hiện nay trên thị trƣờng cũng đã có những sản phẩm chứa sâm cau nhƣ sản phẩm Ochukim do công ty TNHH Tuệ Linh sản xuất dùng cho bệnh nhân vô sinh nam. Đồng bào các dân tộc thƣờng sử dụng thân rễ cây sâm cau (thƣờng gọi là tiên mao) nhƣ một loại thuốc bổ và đều không gây ra tác dụng không mong muốn.
KẾT LUẬN
Trong khuôn khổ đề tài khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi đã thu đƣợc những kết quả sau:
Định tính đƣợc các nhóm hợp chất trong thân rễ sâm cau bằng phƣơng pháp hóa học và sắc kí lớp mỏng, bao gồm: saponin, phytosterol, alkaloid, đƣờng khử tự do, các hợp chất phenolic, chất béo và caroten. Đồng thời xây dựng đƣợc bộ dữ liệu vân tay sắc kí lớp mỏng TLC.
Chiết xuất, phân lập và xác định đƣợc cấu trúc của 2 hợp chất: β-sitosterol và
Orcinol-3-O-β-D-gulcosidtừ dƣợc liệu sâm cau.
Xác định đƣợc cao chiết cồn của sâm cau không độc, an toàn khi sử dụng. Liều tối đa thử độc tính cấp là 45 g cao/ kg chuột
ĐỀ XUẤT
Qua kết quả nghiên cứu thu đƣợc, chúng tôi cũng xin đƣa ra đề xuất cho hƣớng nghiên cứu tiếp theo:
Tiếp tục phân lập, tinh chế một số hợp chất tinh khiết trong phân đoạn n-hexan ,ethyl acetat và n-butanol.
Tiếp tục nghiên cứu tác dụng sinh học của một số chất phân lập đƣợc từ thân rễ cây sâm cau
Khảo sát mô hình thử độc tính cấp trên các cao chiết phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và n-butanol của thân rễ sâm cau
Đánh giá một số tác dụng sinh học khác của sâm cau, các phân đoạn cũng nhƣ các chất phân lập đƣợc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ môn Dƣợc liệu – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2006), Thực tập Dược liệu
(Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hóa học), Tài liệu nội bộ
2. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV
3. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học HN, tr 198 –