- Tính chất: Tinh thể màu vàng
- Phổ tử ngoại (UV, MeOH, nm): Cho đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 266nm, 324 nm, 365 nm. Đây là các đỉnh đặc trưng của flavonoid.
- Phổ hồng ngoại (IR, KBr, cm-1): Cho các pic đặc trưng 3384 (O-H), 2923, 2852 (C-H), 1659 (C=O), 1609, 1570, 1507 (C=C của vòng thơm) và 1040, 1181 (C-O).
Như vậy, trong công thức của hợp chất DT-3 có nhóm hydroxy (–OH), nhóm oxo (C=O) và nhân benzen trong phân tử.
- Phổ khối (ESI - MS): Cho pic ion phân tử tại m/z=285 [M-H]. Vậy khối lương phân tử của chất DT-3 là 286 đvC.
- Phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR:
Phổ 1H-NMR: (Dung môi đo là hỗn hợp MeOD, tần số máy 500MHz). Phổ 13C-NMR: (Dung môi đo là hỗn hợp MeOD, tần số máy 125MHz).
Phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR cho thấy có 2 tín hiệu proton ghép cặp meta với nhau ở δH=6,20ppm (1H, d, J=2,0Hz) và δH=6,41ppm (1H, d, J=2,0Hz) tương ứng với độ chuyển dịch cacbon lần lượt là δc=99,28 ppm và δc=94,48 ppm, đây là 2 proton ở vị trí C6 và C8 ở vòng A của một flavonoid; 4 proton ghép cặp đôi ortho với nhau ở δH=6,92ppm (2H, d, J=8,5Hz) và δH=8,09ppm (2H, d, J=8,5Hz) tương ứng với độ chuyển dịch δc=130,68ppm và δc=137,12ppm, đây là 4 proton ở vị trí (C3’, C5’) và (C2’, C6’) ở vòng B của một flavonoid. Kết quả từ 15 tín hiệu carbon cũng cho thấy chất DT – 3 là một flavonoid có các nhóm thế hydroxyl được đính vào vị trí C5, C7 trên vòng A và C4’ trên vòng B. Do sử dụng dung môi MeOD để đo NMR nên tín hiệu của nhóm hydroxyl ở vị trí C5 không thấy xuất hiện rõ trên phổ 1 H – NMR. So sánh dữ liệu phổ thu được với tham khảo tài liệu [38], chúng tôi nhận danh hợp chất DT-3 là một flavonoid 3,5,7-Trihydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one, hay kaempferol, với công thức phân tử chất DT-3 là C15H10O6. Kết quả phân tích phổ 1H- và 13C-NMR (đo trong MeOD, chất chuẩn nội là TMS) của chất DT-3 được trình bày trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR chất DT-3 Chất DT-3 Kaempferol Vị trí δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 2 148,07 146,27 3 137,12 135,49 4 177,35 175,54 5 162,48 160,65 6 6,20 (d, 2,0) 99,28 98,07 6,12 (d) 7 165,55 163,67 8 6,41(d, 2,0) 94,48 93,20 6,32(d) 9 158,25 156,12 10 104,55 102,95 1’ 123,74 121,67 2’ 8,09 (d, 8,5) 137,12 129,13 7,97(d) 3’ 6,92 (d, 8,5) 130,68 115,11 6,86(d) 4’ 160,52 158,89 5’ 6,92 (d, 8,5) 130,68 115,11 6,86(d) 6’ 8,09 (d, 8,5) 137,12 129,13 7,97(d) Vậy, DT3 là kaempferol, công thức cấu tạo như Hình 3.18
Hình 3.17. Công thức cấu tạo của DT3 (kaempferol)
3.3.4.2. Xác định cấu trúc DT4:
- Tính chất: Tinh thể màu vàng xanh
- Phổ tử ngoại (UV, MeOH, nm): Cho đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 255nm, 294 nm, 362nm. Là các đỉnh đặc trưng của flavonoid
- Phổ hồng ngoại (IR, KBr, cm-1): Cho các pic đặc trưng 3405 (O-H), 2923, 2852 (C-H ), 1664 (C=O), 1612, 1520, 1457 (C=C của vòng thơm) và 1010, 1165 (C-O).
Như vậy, trong công thức của hợp chất DT-4 có nhóm hydroxy (–OH), nhóm oxo (C=O) và nhân benzen trong phân tử.
- Phổ khối (ESI - MS): Cho 2 pic cường độ lớn tại m/z=285 [M-H] và tại m/z=301 [M-H].
Dự đoán DT4 là hỗn hợp của 2 chất (ký hiệu là DT4-A và DT4-B) với khối lượng phân tử của mỗi chất lần lượt là 286 đvC và 302 đvC.
- Phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR
Phổ 1H-NMR: (Dung môi đo là MeOD, tần số máy 500MHz). Phổ 13C-NMR: (Dung môi đo là MeOD, tần số máy 125MHz).
Quan sát trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của 11 proton của hợp chất có vòng thơm. Qua tìm hiểu tài liệu và phân tích dữ liệu phổ khối nhận danh 10 proton này là 10 proton của 2 phân tử DT4-A và DT4-B.
Trên phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR cho 2 nhóm tín hiệu proton ghép cặp meta với nhau. Nhóm tín hiệu thứ nhất bao gồm 2 proton ở δH=6,23ppm (1H, d, J=2,5Hz) và δH=6,45ppm (1H, d, J=2,5Hz) tương ứng với độ chuyển dịch cacbon lần lượt là δc=100,12 ppm và δc=95,01ppm là 2 proton ở vị trí C6 và C8 vòng A của một flavonoid. Nhóm tín hiệu thứ hai bao gồm 2 proton ở δH=6,20ppm (1H, d, J=2,0Hz) và δH=6,41ppm (1H, d, J=2,0Hz) tương ứng với độ chuyển dịch cacbon lần lượt là δc=99,25 ppm và δc=94,43ppm là 2 proton ở vị trí C6 và C8 vòng A của một flavonoid thứ hai. Ngoài ra trên phổ
1H-NMR xuất hiện 1singlet δH=6,55 là tín hiệu proton ở vị trí C3 vòng C của 1 flavon. tín hiệu multi của 2 proton ở độ chuyển dịch 7,39ppm là 2 proton ở vị trí C2’ và C6’ vòng B của một flavoloid, 2 proton lần lượt ở độ chuyển dịch 7,75 (1H, d, J=2,0Hz) và δH=7,65ppm (1H, dd, J=2,0Hz và J=8,5) tương ứng với độ chuyển dịch cacbon lần lượt là δc=116,01 ppm và δc=121,70 ppm là 2 proton ở vị trí C2’ và C6’ vòng B của flavonoid thứ hai.
Qua phân tích dữ liệu phổ của chất DT4 (hỗn hợp DT4-A và DT4-B) và tham khảo dữ liệu phổ của 2 chất là quercetin và luteolin [17], [32] chúng tôi nhận danh DT4 là hỗn hợp 2 chất với DT4-A là luteolin và DT4-B là quercetin.
Kết quả phân tích phổ 1H- và 13C-NMR (đo trong MeOD, chất chuẩn nội là TMS) của chất DT4-A và DT4-B được trình bày trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR chất DT4-A và DT4-B DT4 – Quercetin DT4 - Luteolin DT4 - B Quercetin DT4 - A Luteolin Vị trí δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 2 148,02 146,8 165,97 164,2 3 137,21 135,6 6,55 (s) 103,86 6,59 103,6 4 177,32 175,7 183,86 182,4 5 163,17 160,6 162,46 162,7 6 6,20 (d, 2,0) 99,25 6,18 98,1 6,23 (d, 2,5) 100,12 6,25 99,0 7 166,36 163,8 165,97 164,5 8 6,41 (d, 2,0) 94,43 6,40 93,3 6,45 (d, 2,5) 95,01 6,52 94 9 158,22 156,1 159,40 158,1 10 102,9 103,0 104,8 104,7 1’ 124,14 121,9 123,7 123,1 2’ 7,75 (d, 2,0) 116,01 7,67 115,1 7,39 114,18 7,51 113,5 3’ 146,21 145,0 147,01 145,8 4’ 148,76 147,6 150,96 149,4 5’ 6,91 116,24 6,89 115,5 6,91 116,79 7,00 116,0 6’ 7,65 (dd, 2,0; 8,5) 121,70 7,53 119,9 7,39 120,31 7,48 119,5 Vậy, DT4 là hỗn hợp hai flavonoid là quercetin và luteolin có công thức cấu tạo như Hình 3.18 và Hình 3.19.
Hình 3.18. Công thức cấu tạo của DT4 - B (Quercetin)
Hình 3.19. Công thức cấu tạo của DT4 – A (Luteolin)
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. Về phương pháp:
Phần thực nghiệm nghiên cứu đã áp dụng kết hợp các phương pháp nghiên cứu dược liệu học từ kinh điển, cơ bản, thường quy, đơn giản đến hiện đại, đòi hỏi phương tiện kỹ thuật cao. Nghiên cứu hình thái phân loại thực vật, từ quan sát cảm quan trên thực địa, mẫu thu hái, chụp ảnh, đối chiếu với mô tả trong các tài liệu phân loại thực vật chuẩn, kinh điển, so sánh với mẫu chuẩn lưu trữ, nghiên cứu vi học hiển vi. Về hóa thực vật, phương pháp nghiên cứu bao gồm từ định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học trong ống nghiệm, chiết ngâm lạnh, chiết phân đoạn, sắc ký lớp mỏng định tính và điều chế, sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao, phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân H1, C13, phổ khối. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một số nhóm chất thường gặp trong dược liệu được định tính bằng phản ứng hóa học đặc hiệu thông thường. Đây là phương pháp phổ biến, từ lâu đã trở thành thường quy trong dược liệu học. Tuy đơn giản mà tính đặc hiệu cao và rất tin cậy, đặc biệt có kết hợp với SKLM.
Về chiết tách, trong số rất nhiều phương pháp chiết xuất trong nghiên cứu, vì mục đích nghiên cứu thành phần hóa học, chiết ngâm lạnh được lựa chọn vì tính đơn giản (thiết bị, phương tiện rẻ tiền, dễ kiếm), dễ tiến hành, đặc biệt ít gây biến đổi hóa học sản phẩm chiết. Tiếp đến là SKLM và SKC. SKLM dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, mà độ nhạy cao (đòi hỏi lượng mẫu ít) … nên được dùng rất rộng rãi để định tính, theo dõi phản ứng hóa học, quá trình sắc ký điều chế (SKC), chiết phân đoạn… trong nghiên cứu hóa học, hóa dược, sinh hóa, dược liệu… Trong luận văn, SKLM được sử dụng để định tính các chất trong cắn các phân đoạn chiết, thăm dò hệ dung môi để lựa chọn hệ dung môi chiết, phân lập, kiểm tra các phân đoạn trong quá trình phân lập. SKC hiệu quả tách cao, phân đoạn dễ tinh sạch (theo dõi bằng SKLM), đặc
biệt là nhẹ nhàng, không hay ít gây biến tính, bảo toàn nguyên vẹn chất chiết, mà tiến hành đơn giản, chi phí thấp.
4.2. Về thực vật:
Cây Mũi mác [Desmodium triquetrum (L.) DC.] thuộc họ Đậu (Fabaceae), chi Desmodium. Chi Desmodium là một chi lớn thuộc họ Đậu với khoảng 350 loài thực vật đa số được sử dụng làm ngũ cốc và thảo dược. Hiện nay chỉ có khoảng 30 loài được nghiên cứu về đặc điểm thực vật, tính chất hóa học và tác dụng sinh học. Ngoài mô tả hình thái, phân loại trên thực địa, trên mẫu thu hái, nghiên cứu vi học bao gồm làm vi phẫu các bộ phận, soi hiển vi bột dược liệu góp phần mô tả chính xác cây Mũi mác, cung cấp thêm “tiêu chuẩn”, góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu chặt chẽ hơn, chính xác hơn, tránh nhầm lẫn.
4.3. Thành phần hóa học:
Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu Mũi mác, sơ bộ phát hiện trong Mũi mác có: Flavonoid, saponin, tanin, chất béo, steroid, caroten, đường khử, acid hữu cơ.
Từ cắn phân đoạn ethylacetat qua SKC phân lập được 2 chất tinh khiết DT1, DT3 và một hỗn hợp hai flavonoid (DT4-A, DT4-B). Bằng SKLM đối chiếu với chất chuẩn, phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), cộng hưởng từ (NMR) xác định được DT1 là β-sitosterol, DT3 là kaempferol, DT4 là hỗn hợp quercetin và luteolin. Trong đó lượng chất tinh khiết chiết tách được cao là DT3 (kaempferol) (khoảng 50mg). Ba chất flavonoid tách được từ cây Mũi mác đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh học của chúng như: Kaempferol có tác dụng tăng cường tính thấm, lợi tiểu, được dùng điều trị các bệnh đường tiết niệu, dị ứng [38]. Quercetin có khả năng chống bệnh phổ rộng (lây nhiễm, viêm khớp, hen phế quản, dị ứng da và những bệnh màng nhầy, tim mạch, đái tháo đường), bao gồm cả ung thư [37]. Luteolin đã được
dùng để điều trị bệnh tăng huyết áp, viêm nhiễm, ung thư,… [26]. Cả ba flavonoid này có mặt trong nhiều cây thuốc như: Aloe vera var.variegata,
Amburana cearensis A. C. Smith, Ammi majus (L) Bullwort, Hypericum
perforatum L.,… Việc phân lập được các chất trên từ cây cũng minh chứng
được các tác dụng dân gian của dược liệu Mũi mác và nâng cao hiệu quả sử dụng. Tuy nhiên, cần tiến hành xác định hàm lượng các chất này có trong dược liệu Mũi mác để làm cơ sở cho việc khai thác.
Sự có mặt của kaempferol, luteolin và quercetin trong cây Mũi mác với những tác dụng được biết đến của nó (chống oxy hóa, sát khuẩn, lợi tiểu, dị ứng, đái tháo đường, ung thư,..) góp phần giải thích chứng minh tác dụng của vị thuốc và kinh nghiệm dân gian: Giải độc, kiện tỳ tiêu thực, lợi niệu, sát trùng, nhanh liền sẹo, lao xương, viêm hạch bạch huyết, nhiễm trùng âm đạo
Trichomonas, nấm da cứng. Nghĩa là các tác dụng này có thể là do hay có phần
đóng góp của các flavonoid như kaempferol, luteolin và quercetin. Đây cũng là một đóng góp về tìm hiểu mối quan hệ giữa thành phần hóa học và tác dụng sinh học của dược liệu, chứng minh kinh nghiệm dân gian sử dụng cây Mũi mác, gợi mở các thử nghiệm tác dụng sinh học Mũi mác.
Kết quả nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học của cây Mũi mác cho phép định hướng nghiên cứu tiếp theo và nâng cao giá trị sử dụng cũng như giá trị kinh tế của cây Mũi mác.
51
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
Qua nghiên cứu chúng tôi thu được một số kết quả sau:
1. Mô tả hình thái, đối chiếu tài liệu tham khảo, kết luận: Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Desmodium triquetrum (L.) DC. thuộc họ Đậu (Fabaceae) hay còn có tên khoa học là: Tadehagi triquetrum (Linnaeus) H. Ohashi. Tiến hành làm vi phẫu lá, thân, rễ, soi bột dược liệu của mẫu nghiên cứu.
2. Định tính thành phần hóa học bằng phản ứng học thấy cây Mũi mác có flavonoid, saponin, tanin, chất béo, steroid, caroten, đường khử, acid hữu cơ. Từ cắn Ethylacetat đã phân lập được 2 chất tinh khiết DT1, DT3 và một hỗn hợp 2 flavonoid (DT4). Trong đó xác định được DT1 là β-sitosterol, DT3 là kaempferol, DT4 là hỗn hợp quercetin và luteolin.
Kiến nghị:
Các kết quả của đề tài đã đáp ứng đầy đủ các mục tiêu đề ra. Tuy nhiên, công trình này chỉ là bước đầu, các kết quả mới chỉ là những sơ bộ ban đầu về dược liệu Mũi mác.
Vậy, chúng tôi xin đưa ra một số đề xuất như sau: - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của cây Mũi mác.
- Nghiên cứu tác dụng sinh học của dịch chiết từ cây Mũi mác cũng như các thành phần hóa học phân lập được.
- Nghiên cứu biến động thành phần hóa học của cây Mũi mác theo điều kiện sinh thái, khí hậu, thời tiết, thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây; phân tích đầy đủ hơn về thành phần hóa học của cây (định tính và định lượng)
- Điều tra tài nguyên và biện pháp bảo vệ nguồn tài nguyên dược liệu, nguồn gen
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Nguyễn Tiến Bân (2001), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, NXB. Nông Nghiệp, 35, 115. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2005), Thực vật học, NXB. Y học, 57-126, 211, 268-271
3. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản KHKT Hà Nội, 315 – 316.
4. Bộ môn Dược liệu-Trường Đại học Dược Hà Nội (1999), Thực tập dược
liệu-Phần hoá học.
5. Bộ môn Dược liệu-Trường Đại học Dược Hà Nội (1999), Thực tập Dược liệu-Phần vi học.
6. Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội (2004), Thực tập thực vật
và nhận biết cây thuốc.
7. Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội (1997), Thực vật dược- Phân loại thực vật.
8. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 173
9. Dược điển Việt Nam IV - Bộ y tế (2010), Nhà xuất bản y học Hà Nội 10. Nguyễn Văn Đàn (1980), Thuốc đường ruột từ cây cỏ trong nước, NXB Y học, tr. 66 – 74.
11. Hồ Đắc Hùng (2013), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học một số loài thuộc chi Agrimonia họ Hoa hồng (Rosaceae) , Luận văn thạc
sỹ trường đại học Khoa học tự nhiên.
12. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, 814, 914, 920
13. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế
Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong
14. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB. Y học, 697
15. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 875 - 876, 896 - 897.
16. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 114, 315 - 316.
Tài liệu tiếng anh
17. Adeyemi, M.M, DA Adebote, J. O. Amupitan (2010), “Antifeedant activity of quercetin isolated from the Stem Bark of Bobunnia
madagascariensis (Desv.) J. H. Kirk & Wiersema (Caesalpiniaceae)”,
Australian journal of basic and applied sciences, 4 (8): 3342 – 3346.
18. Annie Shirwaikar, Shilpa Jahagirdar, A.L Udupa (2003), “Wound Healing Activity Of Desmodium Triquetrum Leaves”, Indian Journal of
Pharmaceutical Sciences, Vol. 65 (5), 2003, 461-464
19. G.A. Kalyani, Purnima Ashok, A.D. Taranalli, C.K. Ramesh, V. Krishna và A.H.M Viswanatha Swamy (2011), “Anti-inflammatory and in vitro antioxidant activity of Desmodium triquetrum (L.”), Indian J Pharmacol, Nov-Dec; 43(6): 740–741
20. GA Kalyani, CK Ramesh, V Krishna (2011), “Hepatoprotective and antioxidant activities of Desmodium triquetrum DC.”, Indian J Pharmacol
2011, 73, 4, 463-466
21. Gangwal A., Parmar S.K., Sheth N. R. (2010), “Triterpenoid, flavonoids, and sterol from Lagenaria Siceraria fruits”, Der Pharmacia Lettre, 2 (1), 307 – 317.
22. Grin Species Record of Desmodium, National Germplasm Resources (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
23. Hkun Saw Lwin Tu, Margaret (1968), “Effect of Desmodium Triquetrum
extract on some pathogenic bacteria”, Union of Burma Journal of Life
Sciences, 1-Jan-1968
24. Hsuen Shui – Lo (1995), Flora of China, vol 5, pp. 30 – 33.
25. Khin Chit; Win Myint; Kyi Thein; Win Win Maw; Mar Mar Myint; Aye Than; Myo Khin (2001), “Cyclic AMP Phosphodiesterase Inhibitory Activity and Chemical Screening of Four Medicinal Plants”, Pharmaceutical Biology, 39, 3 2001 , 181 – 183
26. Lin Y, Shi R, Wang X, Shen HM (2008), “Luteolin, a flavonoid with potential for cancer prevention and therapy”, Curr Cancer Drug
Targets.;8(7):634-46
27. Ma X, Zheng C, Hu C, Rahman K, Qin L (2011), “The genus Desmodium
(Fabaceae)-traditional uses in Chinese medicine”, Phytochemistry and