và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối t−ợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Đối t−ợng nghiên cứu
- Các loài hoa cây cảnh thuộc họ Hành.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
+ Th−ớc thẳng, th−ớc kẹp panme, th−ớc đo vật kính và th−ớc đo thị kính, kính hiển vi quang học, mũi mác, lamen, lam kính, hộp petri,…
+ Hoá chất: KI, I, axitboric, agar, Botrac, đ−ờng saccarosa (để xác định sức sống và khả năng nảy mầm của hạt phấn).
3.1.3. Địa điểm
- Địa bàn điều tra, thu thập: Hà Nội, Hải D−ơng, Hải Phòng
- Tập đoàn các loài hoa cây cảnh thu thập đ−ợc trồng, chăm sóc và theo dõi tại v−ờn thực vật và nhà l−ới của Bộ môn Thực vật Khoa Nông học.
- Phân loại nguồn gen thu thập nghiên cứu và một số chỉ tiêu sinh học đ−ợc tiến hành tại bộ môn Thực vật Khoa Nông học.
3.1.4. Thời gian
Từ tháng 10 năm 2007 đến tháng 10 năm 2008: 3.2. Ph−ơng pháp và nội dung nghiên cứu
3.2.1. Ph−ơng pháp nghiên cứu
* Ph−ơng pháp bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm theo dõi tập đoàn: Bố trí tuần tự không nhắc lại.
* Ph−ơng pháp nghiên c−ú các chỉ tiêu
- Điều tra số l−ợng cây và giá trị th−ơng mại của cây bằng ph−ơng pháp phỏng vấn nhanh.
và ph−ơng pháp tế bào học.
- Nghiên cứu một số đặc điểm thực vật học d−ới kính hiển vi bằng ph−ơng pháp hiển vi dùng cho nghiên cứu thực vật và d−ợc liệu.
3.2.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu các chỉ tiêu
3.2.2.1. Các chỉ tiêu về hình thái, kích th−ớc thân lá
- Chiều cao cây (cm): Đo từ đỉnh thân hành đến mút lá cao nhất, đo khi cây bắt đầu ra hoa.
- Đ−ờng kính thân hành, độ dầy thân hành (cm): Đo bằng th−ớc kẹp panme, đo sau khi thu hoạch hoa.
- Màu sắc thân hành: Quan sát và mô tả. - Số lá trên cây: Đếm khi cây bắt đầu ra hoa. - Màu sắc lá: Quan sát và mô tả.
- Chiều dài, chiều rộng lá (cm): Đo những lá đ/ ổn định về mặt hình thái. - Độ dầy lá (mm): Dùng dao lam cắt ngang ở phần giữa của lá, chỉ lấy một lát rất mỏng đặt lên lam kính và đ−a lên quan sát d−ới kính hiển vi ở vật kính 4. Đo ở vị trí dầy nhất của lá, đếm số vạch nhỏ trên th−ớc đo thị kính. Độ dầy lá đ−ợc tính nh− sau:
Độ dầy lá = Số vạch trên th−ớc đo thị kính x 25 (àm)
Trong đó: 25 àm là chiều dài một vạch của th−ớc đo thị kính ở vật kính 4. Kết quả đ−ợc kế thừa theo ph−ơng pháp tính của bộ môn Thực vật – Tr−ờng ĐHNNHN.
3.2.2.2. Các chỉ tiêu về hình thái, đặc điểm ra hoa
- Thời gian từ nhú ngồng đến khi nở hoa đầu tiên (ngày): Quan sát và ghi chép.
- Số hoa trên cụm (hoa): Quan sát và ghi chép. - Màu sắc hoa: Quan sát và mô tả.
- Thời gian hoa nở trong ngày (giờ): Quan sát và ghi chép.
ghi chép.
- Độ bền của một hoa (ngày): Quan sát và ghi chép. - Độ bền của một cụm hoa (ngày): Quan sát và ghi chép.
- Chiều dài trục hoa (cm): Đo từ gốc trục hoa đến vị trí mang hoa.
- Đ−ờng kính trục hoa (cm): Đo bằng th−ớc panme, đo ở vị trí to nhất của trục.
- Đ−ờng kính hoa khi nở hết (cm): Đo bằng th−ớc thẳng. - Chiều dài của vòi nhị cái (cm): Đo khi nhị cái chín.
- Độ dầy cánh hoa (mm): Làm t−ơng tự nh− độ dầy lá, cắt ngang một lát rất mỏng ở phần giữa của cánh hoa, đặt lên lam kính rồi đ−a lên quan sát d−ới kính hiển vi ở vật kính 4. Cách tính cũng t−ơng tự nh− tính độ dầy lá.
3.2.2.3. Các chỉ tiêu về hình thái, chất l−ợng hạt phấn
- Hình thái hạt phấn: Làm tiêu bản hạt phấn rồi quan sát d−ới kính hiển vi quang học và mô tả.
Để làm tiêu bản hạt phấn, chúng tôi tiến hành nhuộm hạt phấn bằng dung dịch I-KI 1%, theo ph−ơng pháp tiếp thu của Bộ môn Di truyền giống – Tr−ờng ĐHNN Hà Nội.
+ Cách pha dung dịch I-KI 1%,:
Cân 0,25g I2 cho vào 10ml cồn 960, lắc kỹ cho tan hết Cân 0,25g KI cho vào 15ml n−ớc cất, lắc cho tan hết
Trộn lẫn 2 dung dịch với nhau, lắc đều đ−ợc dung dịch I-KI 1%. + Làm tiêu bản hạt phấn:
Nhỏ một giọt dung dịch I-KI 1% lên lam kính sạch.
Dùng kim mũi mác lấy hạt phấn hoà vào giọt dung dịch, dùng đầu kim khẽ hoà tan để các hạt phấn tách rời nhau ra.
Đậy lamen.
Đ−a lam kính lên quan sát d−ới kính hiển vi.
- Kích th−ớc hạt phấn (àm): Tiến hành đo kích th−ớc hạt phấn ở vật kính 40. Xoay th−ớc đo thị kính sao cho th−ớc đo trong tr−ờng kính trùng với
chiều dài hạt phấn để đo chiều dài và vuông góc với chiều dài hạt phấn để đo chiều rộng. Đếm số vạch nhỏ trên th−ớc đo. Kích th−ớc hạt phấn đ−ợc tính theo công thức sau:
Kích th−ớc hạt phấn = Số vạch trên th−ớc đo thị kính x 2,5 (Đơn vị:àm) Trong đó: 2,5 àm là độ dài một vạch trên th−ớc đo thị kính ở vật kính 40. - Xác định sức sống hạt phấn khi vừa tung: Quan sát tiêu bản hạt phấn, đếm số hạt phấn bắt màu xanh sẫm, số hạt phấn không bắt màu, bắt màu nhạt và hạt phấn dị dạng sau đó tính tỉ lệ hạt phấn có sức sống theo công thức sau:
Số hạt phấn bắt màu sẫm
x 100 Tổng số hạt phấn
- Xác định sức sống của hạt phấn trong quá trình bảo quản:
Trong thí nghiệm này chúng tôi xác định sức sống hạt phấn tại 5 thời điểm: Vừa tung, sau tung 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 12 giờ và trong 3 điều kiện bảo quản khác nhau:
ĐKBQ 1: Bảo quản trong điều kiện phòng thí nghiệm.
ĐKBQ 2: Bảo quản trong điều kiện phòng thí nghiệm có thêm hạt hút ẩm. ĐKBQ 3: Bảo quản trong ngăn rau của tủ lạnh thông th−ờng có hạt hút ẩm. Làm tiêu bản hạt phấn và tính tỉ lệ hạt phấn có sức sống t−ơng tự nh− khi xác định sức sống hạt phấn vừa tung.
- Xác định khả năng nảy mầm của hạt phấn: Để xác định khả năng nảy mầm của hạt phấn chúng tôi tiến hành cấy hạt phấn trên môi tr−ờng dinh d−ỡng nhân tạo theo Trancovski, có bổ sung một số chất kích thích.
+ Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất: Bình tam giác, đèn cồn, đĩa Petri, lamen, giấy lọc, n−ớc cất, agar, đ−ờng saccaroza, axit boric, botrac, bao phấn mang hạt phấn vừa tung.
+ Môi tr−ờng nuôi cấy hạt phấn chứa 1% agar, 10% đ−ờng saccarosa có bổ sung axit boric hoặc botrac. Trong phần này chúng tôi thực hiện hai thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: So sánh tỉ lệ nảy mầm của hạt phấn giữa các dạng LK trên cùng một môi tr−ờng. ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng môi tr−ờng có bổ sung axit boric 0,003%.
Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ botrac trong môi tr−ờng cho tỉ lệ nảy mầm của hạt phấn là cao nhất. Thí nghiệm này chúng tôi tiến hành nuôi cấy hạt phấn của loài LK đỏ th−ờng, sử dụng botrac ở 4 nồng độ: 0,04%; 0,05%; 0,06%; 0,07% và đối chứng là môi tr−ờng không có botrac.
+ Các b−ớc tiến hành nh− sau: Tạo môi tr−ờng cấy hạt phấn:
Ngâm 1g agar trong 50 ml n−ớc cất cho nở.
Hoà tan 10g đ−ờng saccarosa trong 50 ml n−ớc cất.
Hỗn hợp 2 dung dịch trên vào bình tam giác, đun trên ngọn lửa đèn cồn. Sau khi sôi cho axit boric hoặc botrac vào khuấy đều.
Cấy hạt phấn:
Dùng côngtơ hút, hút dung dịch môi tr−ờng trải đều lên các lam kính khi dung dịch còn ở dạng lỏng. Sau khi nguội môi tr−ờng cấy ở dạng thạch, dùng tăm bông lấy phấn từ bao phấn chấm thật nhẹ lên môi tr−ờng cấy. Chú ý chấm phấn sao cho hạt phấn trải thật đều và thật th−a trên bề mặt môi tr−ờng.
Sau khi cấy phấn, lam kính đ−ợc đặt trong đĩa Petri 2 mặt có lót giấy lọc thấm n−ớc để tạo độ ẩm b/o hoà.
Quan sát sự nảy mầm của hạt phấn ở vật kính 10, tính tỉ lệ nảy mầm tại 4 thời điểm: 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ sau khi cấy. Tỉ lệ nảy mầm của hạt phấn đ−ợc tính theo công thức sau:
Số hạt phấn nảy mầm trong quang tr−ờng
x 100 Tổng số hạt phấn trong quang tr−ờng
Xác định chiều dài của ống phấn:Tiến hành đo chiều dài ống phấn ở vật kính 10, tại 4 thời điểm 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ sau khi cấy. Điều chỉnh sao cho th−ớc đo thị kính trong tr−ờng kính trùng với ống phấn, gốc của ống
phấn (xuất phát từ hạt phấn) trùng với vạch 0 trên th−ớc. Kích th−ớc của ống phấn đ−ợc xác định bằng số vạch nhỏ trên th−ớc tính từ vạch 0 đến vạch t−ơng ứng với đầu ống phấn.
Nếu chiều dài của ống phấn đ/ v−ợt quá chiều dài của th−ớc: Ta cũng đặt th−ớc giống nh− trên, sau đó, tại vạch cuối cùng của th−ớc ứng với vị trí nào trên ống phấn thì ta đánh dấu vị trí đó một cách t−ơng đối bằng cách so sánh với một hạt phấn khác cùng trong tr−ờng kính. Tiếp theo, ta di chuyển tiêu bản để đ−a vị trí vừa đánh dấu trùng với vạch 0 trên th−ớc và đếm số vạch. Nếu chiều dài ống phấn gấp nhiều lần th−ớc thì ta cũng làm t−ơng tự nh− trên cho đến khi đo đ−ợc hết chiều dài ống phấn.
Chiều dài ống phấn đ−ợc tính theo công thức sau:
Chiều dài ống phấn = Số vạch trên th−ớc đo thị kính x 10 (àm)
Trong đó: 10 àm là độ dài một vạch trên th−ớc đo thị kính ở vật kính 10. 3.2.2.4. Một số chỉ tiêu khác
- Tỉ lệ hạt chắc, hạt lép của quả LK sau khi tụ phấn nhân tạo: Với mỗi quả LK thu đ−ợc trong mỗi tổ hợp lai, đếm số hạt chắc, hạt lép. Tỉ lệ hạt chắc, hạt lép đ−ợc tính nh− sau:
Số hạt chắc
Tỉ lệ hạt chắc = x 100 Tổng số hạt
Tỉ lệ hạt lép = 100% – Tỉ lệ hạt chắc
- C−ờng độ quang hợp: Chúng tôi tiến hành đo c−ờng độ quang hợp bằng máy PP systems ở nhiệt độ 340C, c−ờng độ ánh sáng 32000 lux.
* Thí nghiệm làm tiêu bản NST các dạng LK:
- Mỗi giống LK lấy một củ, cắt bỏ toàn bộ lá và rễ, khi cắt rễ chú ý cắt sát nh−ng không cắt vào củ.
- Giâm các củ LK trong cát ẩm, sau 4-5 ngày sẽ ra rễ. Với một số giống LK khó ra rễ, chúng tôi pha dung dịch ra rễ cực mạnh theo nồng độ khuyến cáo (20g/10 lít n−ớc) sau đó nhúng củ LK trong dung dịch 10 phút rồi giâm
trở lại vào cát.
- Tiến hành cắt rễ vào khoảng 6h30 phút sáng, ngay sau khi cắt rửa sạch rễ bằng n−ớc cất, đặt rễ vào một đĩa thuỷ tinh hơi lõm, cho n−ớc cất ngập rễ rồi đ−a vào ngăn đá của tủ lạnh. Sau khoảng 5 – 10 phút, khi thấy n−ớc đ/ tạo màng trên bề mặt thì lấy đĩa ra ngoài.
- Khi n−ớc trong đĩa đ/ trở lại nhiệt độ bình th−ờng thì chúng tôi tiến hành xử lý hoá chất cho rễ:
+ Ngâm rễ trong oxyquinol 0,02% trong thời gian 3 giờ.
+ Rửa sạch rễ bằng n−ớc cất 3 lần, cho axit axêtic vào đĩa và ngâm rễ trong khoảng từ 18-20 giờ.
+ Gạn bỏ axit axêtic không cần rửa, tiếp tục cho hỗn hợp Cồn + Javel vào đĩa và ngâm rễ trong khoảng 3 giờ.
+ Gạn bỏ nhanh hoá chất và rửa một lần bằng n−ớc cất, tiếp tục cho hỗn hợp axit + cồn vào đĩa và ngâm rễ trong khoảng 1 giờ 15 phút.
+ Gạn bỏ nhanh hoá chất, rửa một lần bằng n−ớc cất, cho dung dịch cồn lo/ng vào đĩa và ngâm rễ trong khoảng 1 giờ 15 phút.
+ Rửa sạch rễ bằng n−ớc cất 3 lần, cho cồn tuyệt đối vào đĩa và ngâm khoảng 25 – 30 phút. B−ớc này có tác dụng làm mềm rễ.
+ Rửa sạch rễ bằng n−ớc cất 3 lần, cho rễ vào lọ thuỷ tinh pênixilin sau đó cho dung dịch cacmin axetic ngập rễ. B−ớc này có tác dụng nhuộm màu NST. Sau khoảng 3 – 4 giờ là có thể làm tiêu bản để quan sát NST d−ới kính hiển vi.
Cách làm tiêu bản: Dùng panh gắp rễ đ/ đ−ợc nhuộm màu đặt lên lam kính. Tay trái cầm panh giữ rễ, tay phải cầm dao lam cắt lấy một phần rất nhỏ ở đầu rễ. Nhỏ lên lam kính một giọt axit axêtic, đậy lamen. Dùng một tờ giấy lọc, bao ra bên ngoài lam kính để thấm hết phần axit axêtic thừa. Sau đó dùng đầu gỗ của kim mũi mác gỗ nhẹ lên lam kính ở vị trí có rễ. Khi quan sát thấy các tế bào đ/ đ−ợc giàn đều thành một lớp mỏng thì đ−a lên quan sát d−ới kính hiển vi.
3.2.3. Ph−ơng pháp xử lý số liệu