Vật liệu nghiên cứu

1.1. Cá thí nghiệm

Thí nghiệm được kế thừa đàn cá rô phi chọn giống NOVIT04 (O.niloticus) thế hệ thứ 7 ở 2 tuổi cộng. Cá bố mẹ được sản xuất từ đề tài “Chọn giống cá rô phi theo tính trạng sinh trưởng và khả năng chịu lạnh” do hợp phần chọn giống cá rô phi, dự án NORAD, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 1 thực hiện. Khối lượng trung bình của cá bố mẹ trước khi đưa vào thí nghiệm thể hiện (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Khối lượng trung bình bố mẹ (TB±SE) trước khi đưa vào giai sinh sản Khối lượng cá bố mẹ CT 1 CT 2 CT 3 Trung bình chung(g/con) 597,5 ± 2,5^a 578,7 ± 2,1^a 575,5 ± 2,2^a Lớn nhất (g/con) 780,5 705,6 758,6 Cá đực Nhỏ nhất (g/con) 550,7 514,6 545,6 Lớn nhất (g/con) 603,4 582,4 595,4 Cá cái Nhỏ nhất (g/con) 482,7 425,2 467,8

Ghi chú: Các giá trị có số mũ giống nhau trong cùng hàng không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P>0,05)

1.2. Thức ăn

Thức ăn sử dụng cho cá thí nghiệm được sản xuất tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 1. Các chỉ tiêu của thức ăn: viên nổi, kích cỡ viên 4mm, hàm

lượng protein thô là 18%, 25% và 30%. Tỷ lệ phối trộn nguyên liệu và các thành phần dinh dưỡng chính cho các công thức thức ăn thí nghiệm được thể hiện (bảng 2.2 và bảng 2.3).

Bảng 2.2: Tỷ lệ phối trộn nguyên liệu trong các công thức thức ăn

Nguyên liệu Khối lượng kg

CT1 CT2 CT3 Ngô 24,0 14,0 8,0 Bột cá 3,0 7,0 12,0 Sắn 14,0 8,0 4,0 Dầu cá 2,0 2,0 2,0 Cám mỳ 30,4 29,3 28,6 Khô đỗ 15,0 29,0 34,0 Bột thịt xương 9,1 8,8 10,6 Choline Chliride 0,1 0,1 0,1 DCP (Ca(H2P04)2 1,7 1,0 0,0 Premix KVTM 0,6 0,6 0,6 Chống mốc 0,1 0,1 0,1 TOTAL 100 100 100

Năng lượng thô (kcal/g) 2,63 2,62 2,63

Protein thô 18,20 24,28 30,20

Chất béo thô 5,01 5,45 5,19

Phốt pho tổng số 1,30 1,31 1,32

Phốt pho dễ tiêu hóa 0,58 0,75 0,95

LYS 1,07 1,41 1,76

MET 0,27 0,38 0,48

CYS 0,29 0,37 0,43

TSAA(MET + SYS) 0,55 0,75 0,91

Bảng 2.3: Thành phần dinh dưỡng của các công thức thức ăn sau khi sản xuất Công thức Độẩm (%) Chất béo thô (%) Protein thô (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Lần 1 _{Lần 2}

CT1 8,85 8,47 4,18 4,84 18,25 _18,16

CT2 8,57 8,14 5,10 5,25 25,14 _24,22

1.3. Ao thí nghiệm

Thí nghiệm sử dụng một ao có diện tích 1200 m², độ sâu 1,5m được dùng để mắc giai nuôi vỗ cá bố mẹ và sinh sản.

1.4. Giai thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên 9 giai cước ni lông mắc trong một ao có cỡ mắt lưới là 1,5mm, diện tích giai là 20m2 với kích thước: 4m x 5m x 1,5m.

Hình 2.1 : Ao và giai bố trí thí nghiệm nuôi vỗ và sinh sản cá rô phi

1.5. Hệ thống ấp trứng và cá con.

Hệ thống ấp trứng cá rô phi được áp dụng theo công nghệ ấp trứng của Học viện Công nghệ châu Á (Thái Lan). Đây là hệ thống cấp thoát nước theo tuần hoàn khép kín. Bể chứa nước bằng inox được đặt cách mặt đất là 2,5m, trên bể đặt phao tự động. Máy bơm tự động bơm nước cấp lên bể theo mức nước đặt của phao, do đó trong quá trình vận hành nước luôn được đảm bảo ổn định về lưu tốc.

Trứng cá rô phi được ấp trên khay bằng nhôm hoặc nhựa. Kích thước khay nhôm: 40 x 25 x 8,5 cm. Các khay dùng ấp trứng được đặt trên giá đỡ (hình 2.2).

Hình 2.2: Hệ thống ấp trứng cá rô phi

2. Bố trí thí nghiệm

2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trên 9 giai trong cùng một ao theo sơ đồ khối ngẫu nhiên hoàn toàn, khoảng cách giữa các giai thí nghiệm từ 0,6 - 0,7m đảm bảo sự đồng nhất về môi trường.

Công thức 1 (ký hiệu CT1): hàm lượng protein trong thức ăn là 18% Công thức 2 (ký hiệu CT2): hàm lượng protein trong thức ăn là 25% Công thức 3: (ký hiệu CT3): hàm lượng protein trong thức ăn là 30%

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi vỗ và sinh sản cá rô phi

CT1 CT2 CT3 CT2 CT3 CT1

CT2 CT1

Cá thí nghiệm được nuôi vỗ và sinh sản trong giai và bố trí theo ba công thức thức ăn, mỗi công thức lặp lại ba lần.

+ Giai đoạn nuôi vỗ và lưu giữ cá bố mẹ qua đông trong giai thưa có kích cỡ mắt lưới A12, kích thước 4x5x1,6m. Giai đoạn này được tiến hành từ ngày 20/12/2007 đến ngày 5/3/2008. Đối với nuôi vỗ tích cực cá bố mẹ mỗi công thức được nuôi tách riêng giai cá đực và giai cá cái đảm bảo chế độ dinh dưỡng không có sự cạnh tranh nhau giữa cá đực và cá cái.

+ Giai đoạn nuôi vỗ thành thục từ 6/3/2008 đến ngày 26/4/2008 tiến hành thu trứng.

Cá bố mẹ đưa vào nuôi vỗ được lựa chọn dựa vào các chỉ tiêu như: đồng đều về kích cỡ, cá khỏe mạnh không bị dị tật, không bị xây sát hay bị bệnh.

Mật độ thả ghép cá bố mẹ trong giai sinh sản là 4,5 con/m². Cá cái được lựa chọn và đưa lên giai trước một ngày sau đó chọn cá đực và ghép vào các giai thí nghiệm với tỷ lệ thả ghép cá đực và cá cái là 1:2 (một con đực ghép với 2 con cá cái). Mỗi giai thí nghiệm 20m² được thả ghép 30 con cá đực và 60 con cá cái đồng nhất trong cả ba công thức.

Do bố trí thí nghiệm trong giai cước mau, cỡ mắt lưới 1,5mm nên 10 ngày tiến hành thu trứng một lần, kéo dài thời gian ấp trứng trong miệng cá cái góp phần làm tăng tỷ lệ của cá nở và giảm thời gian ấp trứng nhân tạo.

2.2. Chăm sóc và quản lý

Giai đoạn nuôi vỗ tích cực cá thí nghiệm được cho ăn lượng thức ăn 1,5% khối lượng cơ thể, cho ăn hai lần trong một ngày vào 8h sáng và 16h chiều.

Giai đoạn nuôi vỗ thành thục và thời gian sinh sản của cá cho ăn 1,5% khối lượng cơ thể từ ngày thứ 1 đến 5 sau khi thu trứng và giảm xuống 1% khối lượng cơ thể từ ngày thứ 6 đến 10 của mỗi lần thu trứng.

Trong quá trình nuôi vỗ tích cực mỗi tháng cấp thêm nước mới 2 - 3 lần, thời gian nuôi vỗ thành thục và cho sinh sản mỗi tuần cấp bổ sung nước mới một lần. Bên cạnh đó dùng máy quạt nước vào mỗi buổi sáng sớm từ 5h - 7h khắc phục hiện tượng thiếu ôxy cục bộ vào buổi sớm.

3. Thu thập và xử lý số liệu

3.1. Phương pháp xác định hàm lượng dinh dưỡng trong thức ăn

• Thiết lập công thức thức ăn cho cá bố mẹ dựa vào phần mềm WUFFA, 2008 MINHVIET.

• Sau khi đã sản xuất thức ăn viên lấy mẫu thức ăn phân tích hàm lượng protein thô, độẩm và chất béo.

+ Xác định độ ẩm: thức ăn được cân và sấy ở điều kiện nhiệt độ 60-70^oC trong 2 giờ, sau đó sấy mẫu ở nhiệt độ 100-105^oC trong 1 giờ, cân mẫu đến khối lượng không đổi. Độẩm có trong mẫu được tính theo công thức sau: Khối lượng mẫu trước khi sấy - khối lượng mẫu sau khi sấy Độẩm (%) = x 100 Khối lượng mẫu trước khi sấy

+ Xác định hàm lượng protein thô bằng phương pháp Kjeldahl: mẫu thức ăn được vô cơ hóa bằng hệ thống Digestion 12 - 1009 Digester Unit. Sau đó được chưng cất bằng Kjeltec system - 1026 Distilling Unit và chuẩn độ bằng

axit sunfuric 0,1N để xác định lượng nitơ và xác định hàm lượng protein tổng số.

V x 6,25 x 0,00142

Protein tổng số (%) = x 100 m

Trong đó: V: Thể tích H2SO4 0,1N (ml) dùng trong chuẩn độ mẫu

0,00142: Lượng nitơ tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N tính bằng g m: Khối lượng mẫu (g)

+Xác định hàm lượng chất béo: chất béo được xác định bằng hệ thống Soxtec HT6 Chất béo (%) = ⁻ _∗100 m b a

Trong đó: a: Khối lượng cốc nhôm chứa mỡ b: Khối lượng cốc nhôm trắng mẫu m: khối lượng mẫu dùng vào định lượng

3.2. Phương pháp xác định các giai đoạn phát triển của trứng cá

Theo dõi các giai đoạn phát triển của trứng dựa vào phương pháp phân biệt các giai đoạn phát triển của noãn bào trong buồng trứng theo 6 giai đoạn của Nikolski, (1963); Tacon, (1996).

Thu mẫu xác định các giai đoạn phát triển của trứng được tiến hành ở ba công thức. Từ tháng 2 đến tháng 4 và tháng 8 đến tháng 10 mỗi tháng thu một lần, mỗi công thức thu 9 con. Bắt ngẫu nhiên mỗi công thức 9 con và lấy đều ở cả ba giai, khi lấy mẫu rồi tiến hành cân khối lượng từng con, mổ bỏ nội quan để quan sát buồng trứng sau đó cân trọng lượng của buồng trứng.

Xác định hệ số thành thục (Hstt) theo công thức:

Ptsd Ptsd (g): Khối lượng tuyến sinh dục Hstt = x 100 Po (g): Khối lượng cá bỏ nội quan Po Hstt(%): Hệ số thành thục

+ Phương pháp nghiên cứu mô học để kiểm tra sự phát triển của tế bào trứng: dùng phương pháp mô tế bào học buồng trứng theo phương pháp của Bộ môn Tế bào học và Sinh học phát triển, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (Đặng Ngọc Thanh, 1980). Quá trình làm tiêu bản mô được tóm tắt bằng hình 2.6.

Hình 2.6: Sơ đồ quá trình làm tiêu bản mô tuyến sinh dục

• Thu mẫu: Mổ cá lấy buồng trứng của cá cái, Buồng trứng được cắt làm ba đoạn đầu, giữa và cuối, cân khối lượng đoạn giữa và lấy mỗi buồng trứng một lát dài 1cm rồi đưa vào hộp cố định ghi rõ xuất xứ và dán nhãn cho từng mẫu.

• Cố định mẫu: miếng mô được cố định bằng dung dịch Boin trong thời gian 48h, sau đó rửa nước và thay bằng dung dịch cồn 75% trong 24h. Thể tích của các dung dịch cố định mẫu gấp 10 lần thể tích mẫu.

• Xử lý mẫu: Khi cố định, mẫu mô sẽ cứng lại. Dùng dao sạch cắt miếng mô thành những miếng nhỏ hơn, bề dày từ 0,2 - 0,5cm. Cho mẫu vào các cassettes đã ghi nhãn và đậy nắp cassettes lại, sau đó nhúng trong dung dịch cồn 70%. Xử lý mẫu mô bằng máy xử lý mẫu tự động. Khử nước ở mẫu bằng dung dịch cồn có nồng độ tăng dần, làm sạch mẫu trong xylen.

• Đúc Parafin: sau khi đã thấm parafin vào mẫu, đặt mẫu vào khuôn đúc, rót parafin nóng chảy vào khuôn. Chỉnh sửa mẫu theo hướng cần cắt và đậy

Xử lý Đúc mẫu Cắt mẫu Nhuộm màu Đọc mẫu Thu mẫu Cố định

cassettes lên. Đặt khuôn trên dàn lạnh cho đến lúc parafin đông cứng lại. Gỡ khối parafin ra khỏi khuôn và gọt thành khối hình thang cân.

Hình 2.7: Đúc paraffin mẫu mô tế bào trứng

• Cắt mẫu: Gắn khối parafin chứa mẫu lên máy cắt mô Microtom, dùng tay quay cắt thành các lát mỏng 0,5µ. Khi các lát cắt được cắt ra tạo thành dải băng mỏng từ lưỡi dao của máy, dùng kẹp thả dải mô trên nước ấm 45- 48⁰C để các lát cắt được dãn phẳng ra. Dùng kẹp nhẹ nhàng tách các lát cắt từ dải mỏng với độ dài thích hợp. Lấy một lam kính sạch luồn xuống dưới lát cắt để vớt chúng từ nước ấm lên. Các lam kính được ghi nhãn bằng đầu bút kim cương. Sấy khô các lam kính 3 - 4h trong tủ sấy 40⁰C.

• Nhuộm màu: Lấy các lam kính đã sấy khô và xếp vào khay rồi tiến hành nhuộm màu Haematoxylin và Eosin. Dán lamen lên lam kính bằng keo Bom Canada sao cho khi xylen bay hơi không tạo ra các vùng không có keo hay có bọt khí để tăng độ bền của mẫu.

• Đọc mẫu: tiêu bản được gắn trên lam kính và phân loại dưới kính hiển vi. Ảnh tiêu bản được chụp bằng kính hiển vi tự động. Khi quan sát mẫu ta thấy nhân b t màu xanh đ m, nguyên sinh ch t b t màu h ng ho c đ .

3.3. Phương pháp thu thập số liệu về khả năng sinh sản của cá rô phi

Khả năng sinh sản của cá được xác định thông qua các chỉ tiêu: tỷ lệ đẻ, tỷ lệ nở, sức sinh sản, năng suất trứng, năng suất bột,... Số liệu về khả năng sinh sản của cá rô phi được tiến hành thu làm 6 đợt:

Lần 1: ngày 26/4/2008 Lần 4: 25/5/2008 Lần 2: ngày 5/5/2008 Lần 5: ngày 9/10/2008 Lần 3: Ngày 16/5/2008 Lần 6: Ngày 19/10/2008 Xác định số lượng trứng và phôi của từng giai đoạn và từng công thức con bằng cách thu trứng từ miệng của từng con vừa mới được đẻ ra (Ranna, 1988), cân mẫu 200 trứng hoặc phôi của mỗi giai đoạn rồi đếm mẫu, cân toàn bộ lượng trứng thu được để tính toàn bộ số lượng trứng của mỗi công thức thí nghiệm mà cá đẻ ra.

B x 200 • Số trứng hay phôi thu được = ---

A Trong đó: B là khối lượng trứng thu được

A là khối lượng trung bình của 200 trứng hay phôi của mỗi giai đoạn Số cá tham gia sinh sản

• Tỷ lệ đẻ (%) = --- x 100 Số cá đưa vào nuôi vỗ Số lượng cá bột nở ra • Tỷ lệ nở (%) = --- x 100 Số lượng trứng đưa vào ấp

Tổng số trứng hay phôi thu được • Sức sinh sản thực tế = --- (số trứng/kg cá cái) Khối lượng cá cái tham gia đẻ (kg)

Tổng số trứng hay phôi thu được • Năng suất trứng = --- (số trứng/kg cá cái) Khối lượng cá cái đưa vào nuôi vỗ (kg)

Tổng số cá bột thu được • Năng suất cá bột = --- (số cá bột/kg cá cái) Khối lượng cá cái đưa vào nuôi vỗ (kg)

3.4. Phương pháp thu thập số liệu về các chỉ số môi trường

- Nhiệt độ nước được đo hai lần trong một ngày vào lúc 7h sáng và 14h bằng nhiệt kế cầm tay.

- Ôxy hòa tan đo bằng bộ test thử, pH được đo bằng bút đo pH cầm tay hãng Hanna một lần trong một ngày vào 7h sáng.

- NH3, NO2 được theo dõi hàng tuần bằng bộ Test thử.

3.5. Xử lý số liệu

Các số liệu sau khi thu nhập được tiến hành tính toán và xử lý qua các phần mềm Excel, SPSS. So sánh kết quả về các chỉ tiêu sinh sản dựa vào các kết quả tính toán cụ thể của bảng số liệu kết hợp với phân tích phương sai (ANOVA). Để xác định ảnh hưởng của hàm lượng protein trong thức ăn đến các chỉ tiêu sinh sản, các số liệu tỷ lệ phần trăm (%) được chuyển đổi thành giá trị Arcsin căn bậc hai trước khi phân tích. Dùng phân tích thống kê mô tả, phân tích phương sai một nhân tố khối ngẫu nhiên (p<0,05).

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

1.1. Thời điểm tham gia sinh sản của cá

Đối với các loài cá nước ngọt nói chung và cá rô phi nói riêng, khả năng thành thục phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó yếu tố nhiệt độ và dinh dưỡng vô cùng quan trọng. Theo chế độ chăm sóc và điều kiện tự nhiên năm nay cá