Xác định hàm lượng acid shikimic trong dược liệu, trong dịch chiết và sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Điều kiện sắc ký
Tham khảo tài liệu [13], [26], [27] và qua thực nghiệm, điều kiện sắc ký được xác định như sau:
+ Cột: Phenomenex C18 (250 x 4,60mm, 5µm).
+ Pha động: dung dịch acid phosphoric 0,01% : acetonitril = 95:5.
+ Bước sóng phát hiện: 213nm. + Tốc độ dòng: 0,8mL/phút.
+ Thể tích mẫu tiêm vào cột: 5µL. + Nhiệt độ buồng cột: 30°C.
Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 25mg acid shikimic chuẩn vào bình định mức 50mL, thêm nước cất, lắc hòa tan hoàn toàn. Thêm nước cất vừa đủ đến vạch. Hút chính xác 5mL, cho vào bình định mức 25mL, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng 0,45µm. dung dịch chuẩn có nồng độ 100µg/mL.
+ Dung dịch thử:
Mẫu thử là dược liệu:
Cân 10g bột Đại hồi gói trong giấy lọc, cho vào bình nón 100mL thêm 50mL nước cất ngâm trưởng nở 2 giờ. Chiết 3 lần, mỗi lần siêu âm 1 giờ với 50mL nước cất. Lọc, rửa bỏ bã dược liệu, gộp dịch chiết 3 lần. Chuyển dịch chiết nước thu được vào bình định mức 250mL, thêm nước đến vạch, lắc đều.
Hút 1mL dịch chiết nước vào bình định mức 25mL, thêm nước đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm, và tiến hành định lượng bằng sắc ký lỏng.
Mẫu thử là dịch chiết: Pha loãng dịch chiết đến nồng độ acid shikimic trong khoảng 50 – 150µg/mL, lọc qua màng 0,45µm và tiến hành định lượng bằng sắc ký lỏng.
Công thức tính
Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi: ( )1 100% .S .f .V m .S .f .a.V m X% C C C T T T T c × = Trong đó:
X%: Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi. mC: Khối lượng acid shikimic chuẩn.
mT: Khối lượng đại hồi đem chiết. SC: Diện tích peak mẫu chuẩn. ST: Diện tích peak mẫu thử.
fC, fT: Hệ số pha loãng của mẫu chuẩn và mẫu thử. VC, VT: Thể tích của dung dịch chuẩn và dung dịch thử. a: Hàm lượng acid shikimic trong mẫu chuẩn.