kích thƣớc khác nhau (CF2: 1000 nm, CF1: 450 nm, CF6: 100 nm)
Hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các hạt nano chitosan đƣợc thể hiện thông qua giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) và MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu). Nồng độ ức tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration) là nồng độ thấp nhất của một kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khoảng 24 giờ nuôi cấy. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC-Minimum bactericidal Concentration) là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% lƣợng vi khuẩn [39].
3.3.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại hạt nano chitosan có kích thƣớc khác nhau thƣớc khác nhau
Để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chế phẩm, tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của nano chitosan so với kháng sinh và chitosan thông qua giá trị MIC, MBC. Sử dụng kháng sinh kanamycin đối với chủng Bacillus subtilis,
Hình 3.16: Điện thế zeta của hạt nano chitosan thu đƣợc từ mẫu CF6
Hình 3.17. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan mẫu CF6
Baciluus cereus và kháng sinh ampicilin đối với chủng Micrococcus luteus, Listonella damsela. Dung dịch chitosan 0,4% đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan chitosan trong acid acetic 1%, sau đó đánh giá tác động trực tiếp của nano chitosan, chitosan, kháng sinh lên vi khuẩn thử nghiệm bằng cách xác định phần trăm lƣợng vi khuẩn chết khi cho tiếp xúc trực tiếp với các dung dịch này (bảng 3.3). Để xác định đƣợc phần trăm ức chế, cần dựa vào số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa nuôi cấy, và công thức tính đƣợc trình bày ở phần phƣơng pháp. (Số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa nuôi cấy đƣợc trình bày ở phần phụ lục 3, 4, 5, 6 trong phần phụ lục).
Bảng 3.3: Khả năng ức chế vi khuẩn của các hạt nano chitosan (%)
Chủng
Nồng độ chế phẩm
(μg/ml)
Khả năng ức chế vi khuẩn của các chế phẩm ở các nồng độ khác nhau (%) Kháng sinh Chitosan Chế phẩm CF2 Chế phẩm CF1 Chế phẩm CF6 Bacillus subtilis 100 100 100 100 100 75 89,58 90,83 50 54,16 50 100 100 40 89,16 91 25 37,5 41,66 45,83 55 0,3125 99,99 0,15625 92,2 0,07813 79 Bacillus cereus 200 100 100 100 100 150 90,55 91,3 100 49,46 56,36 99,97 99,97 75 37,77 90,18 90,55 50 37,22 72,72 81,11 0,625 100 0,3125 99,99 0,2 91,11 0,15625 71,11 Micrococcus luteus 100 99,97 99,99 100 100 50 91,48 93,09 98 100 40 83,3 88,18 90,36 91,9 25 83,63 86,19 2,5 100 1,25 94,8 1 90,74 Listonella damsela 50 99,99 99,99 100 100 25 99,72 99,87 99,99 99,99
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan đƣợc nghiên cứu và công bố trong nhiều tài liệu. Theo những nghiên cứu trƣớc, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong môi trƣờng acid là do sự proton hóa nhóm -NH2 tại vị trí C2 của D-glucosamine. Chitosan mang điện dƣơng sẽ tạo nối trên bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện âm, phá vỡ màng và làm thoát những thành phần chứa bên trong hoặc ức chế sự truyền dƣỡng chất vào trong tế bào [21].
Các chủng vi khuẩn thử nghiệm gồm 3 chủng vi khuẩn gram dƣơng là
Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus và 1 chủng vi khuẩn gram âm là Listonella damsela. Bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc, xác định phần trăm lƣợng vi khuẩn chết khi cho tiếp xúc trực tiếp với CS, nano chitosan cho thấy tác dụng kháng khuẩn của cả chitosan và các loại hạt nano chitosan sau 24h nuôi cấy. Tuy hiệu quả kháng khuẩn của chitosan và các loại hạt nano chitosan không bằng đƣợc các kháng sinh kanamycin và ampicilin nhƣng tác dụng của các chế phẩm này cũng không thể phủ nhận. Hiệu quả kháng khuẩn của các chế phẩm đƣợc thể hiện rõ ràng hơn qua giá trị MIC90 (nồng độ thấp nhất có thể ức chế 90% vi khuẩn phát triển) và giá trị MBC (nồng độ thấp nhất có thể diệt tới 99,9% vi khuẩn).
Bảng 3.4: Giá trị MIC90 và MBC của các chế phẩm với các chủng vi khuẩn nghiên cứu 20 92,16 12,5 79,03 99,70 99,79 99,71 10 89,03 90,96 91,42 6,25 48,38 61,29 70,64 71,93 1,25 100 0,625 99,98 0,3125 99,67 0,2 90,64 0,15625 78,71 Chủng
Giá trị MIC90 và MBC của các chế phẩm (μg/ml)
Kháng sinh Chitosan Chế phẩm CF2 Chế phẩm CF1 Chế phẩm CF6
MIC90 MBC MIC9
0 MBC MIC90 MBC MIC90 MBC MIC90 MBC
Bacillus
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các loại hạt nano chitosan đối với mỗi chủng vi khuẩn không giống nhau, tùy thuộc vào kích thƣớc hạt, nồng độ mà hiệu quả kháng khuẩn cũng không giống nhau. Thông qua giá trị MIC90 và MBC có thể đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của mỗi chế phẩm, giá trị MIC90 và MBC càng thấp thì hiệu quả kháng khuẩn càng tốt. Số liệu trên bảng 3.4 cho thấy, các hạt nano chitosan có kích thƣớc bé hơn thì hiệu quả kháng khuẩn lại tốt hơn. Đối với chủng
Bacillus subtilis, nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan và hạt nano chitosan 1000 nm (CF2) đều là 75 μg/ml, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là 100μg/ml, trong khi nồng độ ức chế tối thiểu của các hạt nano chitosan kích thƣớc 450 nm, 100 nm đều là 40 μg/ml, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là 50 μg/ml. Với chủng Bacillus cereus, khi phơi nhiễm với chitosan và CF2, giá trị MIC90 thu đƣợc là 150 μg/ml, giá trị MBC là 200 μg/ml, nhƣng khi tiếp xúc với hạt nano chitosan có kích thƣớc nhỏ hơn (CF1, CF6), giá trị MIC90, MBC thay đổi, giảm chỉ bằng 1 nửa so với chtiosan và CF2, lần lƣợt là 75 μg/ml, 100 μg/ml, tƣơng ứng và MBC là 50 μg/ml. Tƣơng tự khi thử nghiệm chitosan lên chủng vi khuẩn Micrococcus luteus, nồng độ ức chế tối thiểu, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của chitosan là 50 μg/ml, 100 μg/ml, trong khi MIC90 của các hạt nano chitosan đều là 40 μg/ml, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của CF2, CF1 nhƣ nhau là 100 μg/ml, nhƣng MBC của CF6 giảm xuống chỉ còn 50 μg/ml, chứng tỏ hiệu quả kháng khuẩn của hạt nano chitosan kích thƣớc 450 nm và 100 nm cao gấp 2 lần so với chitosan và hạt nano chitosan kích thƣớc 1000 nm. Kết quả này có thể giải thích do hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc lớn hơn chitosan thông thƣờng nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn so với chitosan. Kích thƣớc hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng khuẩn càng tốt vì ở kích thƣớc nhỏ thì khả năng tác động và thâm nhập của hạt nano qua lớp màng của vi khuẩn tăng lên, hơn nữa ở kích thƣớc nhỏ thì diện tích bề mặt của hạt nano sẽ lớn hơn cho nên khả năng tƣơng
Bacillus cereus 0,2 0,3125 150 200 150 200 75 100 75 100 Micrococcus luteus 1 2,5 50 100 40 100 40 100 40 50 Listonella damsela 0,2 0,625 20 50 10 50 10 25 10 25
tác với vi khuẩn thông qua việc tiếp xúc với bề mặt cũng tăng lên vì thế mà hiệu quả kháng khuẩn của các hạt nhỏ cũng tăng đáng kể so với hạt có kích thƣớc lớn hơn. Đối với cả 2 loại vi khuẩn gram âm và gram dƣơng, hoạt tính kháng khuẩn của các hạt nano chitosan cũng cao hơn hẳn so với chitosan, và hạt nano có kích thƣớc càng bé thì khả năng kháng càng mạnh. Đối với vi khuẩn gram âm là Listonella damsela, nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan là 20 μg/ml, nồng độ ức chế tối thiểu của các loại hạt nano chitosan là 10 μg/ml, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của chitosan và hạt nano CF2 đều là 50 μg/ml, trong khi với hạt nano kích thƣớc nhỏ hơn (CF1, CF6) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu giảm xuống còn 1 nửa là 25 μg/ml. Có thể nhận thấy chủng vi khuẩn gram âm nhạy cảm với chế phẩm hơn nhiều, khi hoạt tính kháng khuẩn gram âm của chế phẩm cao hơn 2-4 lần so với khi thử nghiệm lên các chủng vi khuẩn gram dƣơng. Điều này có thể giải thích là do sự khác biệt về cấu tạo màng tế bào của 2 loại vi khuẩn gram âm và gram dƣơng không giống nhau. Màng vi khuẩn gram âm có lớp peptidoglycan khoảng 7 – 8 nm mỏng hơn so với vi khuẩn gram dƣơng có lớp màng dày khoảng 20 – 80 nm , nên các phần tử nano dễ dàng tấn công và xâm nhập qua màng tế bào, dẫn đến hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn gram âm cao hơn gram dƣơng [41].
Kết quả nhận đƣợc trong nghiên cứu này khá phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả khác. Trong báo cáo về hoạt tính kháng khuẩn của các hạt nano chitosan có mang ion kim loại, Du (2009) đã xác định giá trị MIC, MBC của chitosan đối với chủng vi khuẩn E. coli đại diện cho nhóm Gram âm là 468 μg/ml và 750 μg/ml, tƣơng ứng. Đối với vi khuẩn Gram dƣơng S. aureus, giá trị MIC, MBC của chitosan là 656 μg/ml, và 750 μg/ml, tƣơng ứng. Khi xử lý vi khuẩn với nanchitosan tác giả đã xác định đƣợc giá trị MIC, MBC giảm đi rất nhiều so với chitosan, cụ thể đối với E. coli, giá trị MIC, MBC của nano chitosan là 117 μg/ml và 187 μg/ml, tƣơng ứng. Đối với S.aureus giá trị MIC và MBC của nano chitosan lần lƣợt là 234 μg/ml, và 281μg/ml , tƣơng ứng [32]. Tƣơng tự, với 2 chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng là E. coli K88 và S. aureus ATCC 25923, Qi và cs (2004) cũng đã xác định đƣợc nồng độ ức chế E.coli tối thiểu của chitosan và nano chitosan là 8 μg/ml và 1/16 μg/ml, tƣơng ứng. Nồng độ diệt E.coli tối thiểu của
chitosan và nano chitosan là 64 μg/ml và 1 μg/ml, tƣơng ứng. Với chủng gram dƣơng S. aureus, nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan và nano chitosan là 8 μg/ml và 1/8 μg/ml, tƣơng ứng. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của chitosan và nano chitosan là 32 μg/ml và 4 μg/ml, tƣơng ứng [21]. Nhƣ vậy có thể nhận thấy rằng hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan hiệu quả hơn nhiều so với hoạt tính kháng khuẩn của chitosan, và vi khuẩn gram âm nhạy cảm với chế phẩm hơn so với vi khuẩn gram dƣơng.
3.3.2.Đánh giá khả năng kháng nấm của các loại hạt nano chitosan có kích thƣớc khác nhau
3.3.2.1. Khả năng kháng nấm men Candida albicans của các loại hạt nano chitosan
Hoạt tính đối kháng C.albicans của các loại hạt nanochitosan kích thƣớc khác nhau đƣợc đánh giá nhƣ phần phƣơng pháp mô tả. Kết quả trên bảng 3.5 và 3.6. Để xác định đƣợc phần trăm ức chế, cần dựa vào số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa nuôi cấy, và công thức tính đƣợc trình bày ở phần phƣơng pháp. (Số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa nuôi cấy đƣợc trình bày ở phần phụ lục 7 trong phần phụ lục). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.5: Khả năng ức chế Candida albicanscủa các hạt nano chitosan (%)
Chủng
Nồng độ chế
phẩm (μg/ml)
Khả năng ức chếCandida albicans của các chế phẩm ở các nồng độ khác nhau (%) Kháng sinh Miconazole Chitosan Chế phẩm CF2 Chế phẩm CF1 Chế phẩm CF6 Candida albicans 200 100 100 100 100 100 99,99 99,99 100 100 50 100 99,87 99,93 99.99 99,99 40 88,67 25 99,96 82,85 89,64 95 94,28 20 90,85 91,43 12,5 73,93 76,07 78,21 83,92 10 99,91 5 99,80 2,5 99,55 12,5 93,12
Bảng 3.6: Giá trị MIC90 và MFC của các chế phẩm với chủng Candida albicans
Thông qua giá trị MIC90 (Minimum inhibitory Concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu)và MFC (Minimum Fungicidal Concentration - Nồng độ diệt nấm tối thiểu) khi cho các loại hạt nano chitosan tiếp xúc trực tiếp với nấm da Candida albicans, có thể thấy các chế phẩm có hiệu quả kháng nấm khá tốt với MIC90 = 20 μg/ml - 25μg/ml và MFC = 50 μg/ml. Liều lƣợng này cao gấp 5 lần so với nồng độ ức chế sinh trƣởng C.albicans của Miconazole, một loại kháng sinh phổ biến dùng trong việc điều trị nấm Candida với MIC90 = 6,25 μg/ml và MFC = 10 μg/ml. Tuy không thể so với kháng sinh miconazole nhƣng hiệu quả kháng nấm của chitosan và nano chitosan bƣớc đầu cũng khá khả quan. Cũng nghiên cứu về hoạt tính kháng
Candida của các loại hạt nano chitosan có kích thƣớc khác nhau, Ing và cs (2012) xác định giá trị MIC90 của các hạt nano kích thƣớc 174 nm, 233 nm, 301nm lần lƣợt là 0,25 mg/ml; 0,8572 mg/ml, 0,6072 mg/ml [22]. Có thể nhận thấy hạt nano chitosan có kích thƣớc bé hơn thì hiệu quả kháng nấm tốt hơn so với hạt nano chitosan có kích thƣớc lớn. Theo tác giả, kích thƣớc hạt đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hoạt tính kháng vi sinh của hạt nano, các hạt nhỏ dễ dàng chui qua thành tế bào vi sinh hơn thông qua các kênh ion hay protein vận chuyển, sau đó sẽ tác động tới DNA, từ đó ức chế sự tổng hợp RNA, là nguyên nhân khiến tế bào bị chết [9]. Trong trƣờng hợp hạt nano có kích thƣớc 233 nm nhƣng hiệu quả kháng nấm lại thấp hơn so với hạt có kích thƣớc 301nm là do hạt nano kích thƣớc 301 nm có thế zeta là 54 mV, cao hơn thế zeta của hạt nano kích thƣớc 233 nm là 38 mV. Điện tích bề mặt cũng đóng một vai trò quan trọng trong ức chế sinh trƣởng vi sinh vật của hạt nano bởi điện tích dƣơng trên hạt nano chitosan sẽ tƣơng tác với điện tích âm trên bề mặt vi vinh vật, làm thay đổi cấu trúc màng của tế bào nấm, cuối
6,25 89,45
Chủng Giá trị MIC90và MFC của các chế phẩm (μg/ml)
Candida albicans Kháng sinh Miconazole Chitosan Chế phẩm CF2 Chế phẩm CF1 Chế phẩm CF6
MIC90 MFC MIC90 MFC MIC90 MFC MIC90 MFC MIC90 MFC
cùng gây ra rò rỉ vật liệu nội bào [26].
Candida là một loại nấm men, ký sinh trên bề mặt của da và niêm mạc, bệnh nấm candida không chỉ biểu hiện ngoài da mà còn tạo nên các vết loét hoặc giả mạc trong thực quản, dạ dày, ruột hay bộ phận sinh dục nam nữ. Tuy không gây tử vong nhƣng bệnh thƣờng tái nhiễm dai dẳng, gây khó chịu và ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời. Do vậy việc xác định đƣợc hoạt tính kháng nấm men Candida albicans của chitosan và các loại hạt nano chitosan sẽ rất có ý nghĩa trong việc ứng dụng chúng trong lĩnh vực y dƣợc để điều trị các bệnh do nhiễm nấm candida gây ra.
3.3.2.2. Khả năng kháng nấm mốc của các loại hạt nano chitosan có kích thƣớc khác nhau
Hoạt tính đối khángnấm của các loại hạt nanochitosan kích thƣớc khác nhau đƣợc đánh giá nhƣ phần phƣơng pháp mô tả. Kết quả trên bảng 3.7 và 3.8. Để xác định đƣợc phần trăm ức chế, cần dựa vào số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa nuôi cấy, và công thức tính đƣợc trình bày ở phần phƣơng pháp. (Số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa nuôi cấy đƣợc trình bày ở phần phụ lục 8,9 trong phần phụ lục).
Bảng 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc của các hạt nano chitosan (%)
Chủng Nồng độ chế phẩm (μg/ml) Khả năng ức chế nấm mốc của các chế phẩm ở các nồng độ khác nhau (%) Kháng sinh Chitosan Chế phẩm CF2 Chế phẩm CF1 Chế phẩm CF6 Fusarium oxysporum 125 100 100 100 100 62,5 99,99 99,99 100 100 31,25 99,31 99,95 100 100 25 89,4 91,87 99,99 99,99 15,625 62 77,27 97,27 96,9 7,813 92,72 91,54 6,5 85,4 86,4 50 100 35 90,63 25 86,48 Aspergillus awamori 1000 100 100 100 100 500 97,7 98,3 100 100
Bảng 3.8: Giá trị
MIC90 và MFC
của các chế phẩm với các chủng nấm sợi nghiên cứu
Kết quả trên bảng 3.8 cho thấy hoạt tính kháng nấm của chitosan và các loại hạt nano chitosan đối với các chủng nấm không giống nhau. Nhìn chung các loại hạt nano chitosan có kích thƣớc bé (450 nm và 100 nm) kháng nấm tốt hơn so với chitosan và hạt nano chitosan có kích thƣớc 1000 nm.
Đối với chủng Fusarium oxysporum, khi cho chitosan và hạt nano chitosan kích thƣớc 1000 nm tiếp xúc trực tiếp với đối tƣợng, cả 2 chế phẩm đều có cùng 1 nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của nấm là 25 μg/ml. Nếu nhƣ chitosan cần 62,5 μg/ml để diệt nấm Fusarium thì hạt nano chitosan kích thƣớc 1000 nm (CF2) chỉ cần liều lƣợng bằng 1 nửa đã có thể ức chế hoàn toàn sinh trƣởng của nấm sau 48h nuôi cấy. Giá trị MIC90 và MFC cũng cho thấy chủng Fusarium oxysporum rất nhạy cảm đối với các hạt nano chitosan có kích thƣớc bé, ở nồng độ rất thấp khoảng 7,813 μg/ml và 25 μg/ml cả 2 loại hạt nano chitosan kích thƣớc 450 nm (CF1) và hạt nano chitosan kích thƣớc 100 nm (CF6) có thể ức chế và tiêu diệt đƣợc nấm
Fusarium sau 48h nuôi cấy, nhƣ vậy hiệu quả kháng nấm của 2 loại hạt này cao gấp