Ảnh hƣởng của tỷ lệ CS/TPP đến kích thƣớc và sự phân bố hạt nano chitosan đƣợc tiến hành khảo sát với các tỉ lệ lần lƣợt là 4:1, 5:1, 6:1. Nồng độ CS đƣợc giữ cố định là 0,5%(w/v), xử lý CS bằng lò vi sóng 600w / 10 phút, pH= 3-4. Để đáp ứng tỉ lệ CS:TPP lựa chọn, bổ sung TPP 0,5%; 0,4%; 0,3%(w/v).
2.2.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khuấy và tốc độ khuấy
* Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy: Để xác định ảnh hƣởng của tốc độ khuấy lên kích thƣớc hạt nano CS-TPP trong phản ứng ionic gelation, thí nghiệm đƣợc tiến hành với tỉ lệ CS:TPP là 6:1, khuấy trong 2 giờ. Tốc độ khuấy thay đổi 1500; 4000 và 8000 v/ph . CS đƣợc xử lý trƣớc bằng vi sóng ở 600 w trong 10 phút.
chitosan bằng phản ứng ionic gelation cũng có ảnh hƣởng đến kích thƣớc hạt tạo thành. Để xác định đƣợc thời gian khuấy tốt nhất tạo đƣợc hạt nano chitosan với kích thƣớc mong muốn, tiến hành tạo hạt nano chitosan nhƣ thí nghiệm trên (tốc độ khuấy là 8000 vòng/phút) và thời gian khuấy sẽ thay đổi lần lƣợt là 1h, 2h và 3h. Hạt tạo thành đƣợc đo kích thƣớc trên máy Zetasizer Ver. 6.20
2.2.2. Tạo các loại hạt nano chitosan-TPP có kích thƣớc khác nhau bằng phƣơng pháp liên kết ion
Cân chính xác 1 lƣợng chitosan hòa trong acid acetic 1% tạo thành dung dịch chitosan có nồng độ 0,5% (w/v). Xử lý dung dịch chitosan bằng lò vi sóng ở 600w trong 10 phút. Chuẩn bị dung dịch TPP 0,3% (pha TPP trong nƣớc khử ion), tỷ lệ giữa CS/TPP là 6:1. Cho dung dịch TPP chảy qua ống buret 25ml, nhỏ giọt chậm dung dịch TPP vào dung dịch chitosan dƣới tác động của máy đồng hóa IKA T25 digital ULTRA - TURRAX (Đức) với tốc độ khuấy lần lƣợt là 4000 vòng/phút trong 2h, 4000 vòng/phút trong 4h và 8000 vòng/ phút trong 1h.
2.2.3. Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các loại hạt nano
chitosan kích thƣớc khác nhau bằng phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng đặc hiệu của Ing và cs (2012).
B1: Hoạt hóa chủng vi sinh vật trong môi trƣờng lỏng
B2: Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 3ml môi trƣờng thích hợp cho từng loại vi sinh vật có bổ sung nano chitosan ở các dải nồng độ khác nhau. Đối chứng là ống nghiệm chỉ có môi trƣờng nuôi cấy, không bổ sung nanochitosan.Bổ sung vi sinh vật kiểm định đến nồng độ cuối cùng 104 -105 CFU/ml môi trƣờng.
B3: Nuôi ở điều kiện nhiệt độ thích hợp cho từng chủng vi sinh vật trong khoảng thời gian xác định (vi khuẩn nuôi ở 370C trong 12h - 24h, nấm men nuôi 300C trong 12h - 24h, nấm mốc nuôi ở 280C trong 24h - 48h), đánh giá bằng mắt thƣờng sự sinh trƣởng của các chủng vi sinh vật.
B4: Đổ đĩa thạch môi trƣờng MPA (nuôi vi khuẩn), môi trƣờng Hansen nuôi nấm men, môi trƣờng Czapek nuôi nấm mốc.
B5: Lấy 100μl canh trƣờng nuôi từ các ống thí nghiệm ở trên (gồm ống đối chứng và ống có chế phẩm mà không phát hiện sự sinh trƣởng của vi khuẩn), cấy
trải lên đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên. Để khô, lật ngƣợc đĩa và nuôi ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng vi sinh vật. Xác định sự hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng đặc sau 24h nuôi cấy (đối với vi khuẩn và nấm men), sau 48h (đối với nấm mốc). Tiếp sau 24h hoặc 48h nuôi trên môi trƣờng đặc, nồng độ nano chitosan nào thấp nhất có thể tiêu diệt 99,9% lƣợng vi khuẩn đƣợc cho là nồng độ diệt khuẩn tối thiểu, nồng độ nào thấp nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy là nồng độ ức chế tối thiểu [39].
Phần trăm ức chế đƣợc tính theo công thức:
% ức chế = (A0 – As)/A0 * 100%. Trong đó A0 là số khuẩn lạc mọc trên đĩa đối chứng (CFU/ml), As là số khuẩn lạc mọc trên đĩa thí nghiệm (CFU/ml).
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan - TPP 3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử của chitosan
Trên quan điểm lý hóa việc tƣơng tác của chitosan và TPP đƣợc chấp nhận là liên kết chéo trong phân tử của các loại ion tripolyphosphoric, sản phẩm của TPP phân ly trong dung dịch nƣớc, với các nhóm NH3+của chitosan. Ảnh hƣởng của pH, lực ion và các điều kiện sản xuất khác và bản chất của chitosan lên các đặc điểm lý học của các hạt nano chitosan-TPP đã đƣợc nghiên cứu [13]. Khối lƣợng phân tử của chitosan có vai trò quan trọng trong phản ứng liên kết ion để tạo các hạt nano có kích thƣớc mong muốn. Chitosan khối lƣợng phân tử khác nhau có thể nhận đƣợc bằng cách depolymerization có kiểm soát sử dụng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ thủy phân bằng acid (HCl, HNO2, v.v), các gốc tự do (H2O2, K2S2O8), enzymes, chiếu tia (UV, γ rays), siêu âm, vi sóng, và xử lý nhiệt [7].
Để xác định ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử chitosan sử dụng lên một số đặc tính của hạt nano chitosan tạo thành, trƣớc khi tiến hành phản ứng ionic gelation, chitosan đƣợc xử lý bằng vi sóng để cắt ngắn mạch, sau đó quá trình đƣợc tiến hành nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp.
Xác định khối lƣợng phân tử trung bình của các mẫu chitosan đƣợc xử lý bằng lò vi sóng.
Mẫuchitosan đƣợc xử lý bằng lò vi sóng ở 600w trong khoảng thời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút. Nhƣng mẫu chitosan khi xử lý nhiệt trong thời gian quá dài sẽ có hiện tƣợng cháy. Vì vậy mẫu chitosan sẽ đƣợc xử lý bằng vi sóng ở điều kiện 600w / 5 phút và 600w/ 10 phút để làm giảm khối lƣợng phân tử.
Chitosan sau xử lý đƣợc pha loãng theo nồng độ tăng dần nhƣ đã nói ở phần phƣơng pháp, tiến hành đo độ nhớt bằng máy đo độ nhớt Petrotest, phòng Nhiên liệu dầu mỡ, Viện Hóa học vật liệu, (số liệu đƣợc trình bày trong phụ lục 1, phụ lục 2 phần phụ lục). Độ nhớt đặc trƣng và khối lƣợng phân tử trung bình (KLPTTB)
của mẫu chitosan đƣợc xử lý và không xử lý đƣợc tính toán theo công thức trong phần phƣơng pháp (2.2.1.1), kết quả đƣợc thể hiện nhƣ bảng dƣới đây
Bảng 3.1 : KLPTTB của Chitosan xử lý và không xử lý
Từ kết quả bảng 3.1, có thể nhận thấy chitosan xử lý bằng lò vi sóng có khối lƣợng phân tử trung bình thấp hơn chitosan ban đầu, trong cùng 1 nhiệt độ, thời gian xử lý càng lâu thì khối lƣợng phân tử của mẫu càng giảm. Từ mẫu chitosan ban đầu có KLPTTB là 328 kDa, sau khi xử lý bằng lò vi sóng ở 600w/ 5 phút, KLPTTB giảm không đáng kể, còn 322 kDa, tuy nhiên khi tăng thời gian xử lý lên 10 phút, KLPTTB giảm xuống rõ rệt còn 234 kDa. Nhƣ vậy việc chitosan xử lý bằng lò vi sóng đã có hiệu quả khi thu đƣợc chitosan có khối lƣợng phân tử thấp hơn, và theo nhiều nghiên cứu chitosan có khối lƣợng phân tử khác nhau sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến kích thƣớc hạt nano chitosan tạo ra. Để khẳng định khối lƣợng phân tử của chitosan ảnh hƣởng đến kích thƣớc hạt nano tạo thành, chitosan không xử lý và chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w/ 10 phút đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu tạo hạt nano chitosan bằng phƣơng pháp liên kết ion nhƣ đã mô tả ở phần phƣơng pháp 2.2.1.1.Các hạt nano chitosan tạo thành đƣợc đo kích thƣớc và phân bố hạt bằng máy Zetasizer Ver. 6.20. Kết quả trên hình 3.1 và 3.2.
Mẫu ηo M (kDa)
CS 298,5 328,101
C5 293,4 322,041
C10 216,55 234,592
ηo :Độ nhớt đặc trƣng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M: khối lƣợng phân tử trung bình CS: chitosan không xử lý
C5: chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w/ 5 phút C10: chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w / 10 phút
Kết quả nhận đƣợc cho thấy việc xử lý chitosan bằng lò vi sóng có thể giúp tạo ra đƣợc các hạt có kích thƣớc nhỏ hơn nhiều so với mẫu chitosan không đƣợc xử lý. Trong cùng điều kiện phản ứng, các hạt nano chitosan từ CS xử lý bằng vi sóng có kích thƣớc 971nm, trong khi đó các hạt nano chitosan từ CS không xử lý có kích thƣớc 1254nm.
Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu của các tác giả khác về ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử chitosan đến kích thƣớc hạt nano chitosan đƣợc tạo ra. Thông thƣờng, phân tử lƣợng của chitosan càng lớn thì kích thƣớc hạt nano chitosan tạo thành càng lớn. Nhóm của Hu [6] sử dụng chitosan có phân tử lƣợng lần lƣợt là 50, 100, 150 và 300 kDa, có cùng độ deacetyl hóa là 90% để điều chế hạt nano chitosan tripolyphosphate ở nồng độ chitosan là 1,5 mg/ml, tỷ lệ CS/TPP là 6:1, pH là 4,5. Khi phân tử lƣợng chitosan tăng từ 50kDa đến 150kDa, kích thƣớc hạt không thay đổi đáng kể. Khi phân tử lƣợng chitosan tăng từ 150kDa đến 300kDa, kích thƣớc hạt tăng nhanh từ 173,3nm đến 309,7nm.
Tƣơng tự, nhóm của Gan [28] sử dụng chitosan có phân tử lƣợng thấp, trung
Hình 3.1: Sự phân bố kích thƣớc hạt nano chitosan với chitosan đƣợc xử lý bằng lò
vi sóng 600w/ 10 phút
Hình 3.2: Sự phân bố kích thƣớc hạt nano chitosan với chitosan không xử lý
bình và cao, độ deacetyl hóa lần lƣợt là 86,6%; 84,7% và 82,5% để điều chế hạt nano chitosan tripolyphosphate ở nồng độ chitosan là 0,05% (w/v), tỷ lệ CS/TPP là 4:1, pH là 4,0. Kích cỡ hạt thu đƣợc đối với phân tử lƣợng thấp, trung bình và cao lần lƣợt là 136,2nm; 145,3nm và 155,0nm. Hay nhƣ nhóm của Huang [13] sử dụng chitosan có khối lƣợng phân tử thấp lần lƣợt là 240 kDa, 120 kDa, 77 kDa, 15 kDa, 3,6 kDa để điều chế hạt nano chitosan-TPP ở nồng độ chitosan là 0,05% (w/v), nồng độ TPP là 0,04% (w/v), kích cỡ hạt thu đƣợc tƣơng ứng với các mẫu chitosan có khối lƣợng phân tử khác nhau lần lƣợt là 176 nm, 132 nm, 116 nm, 101 nm và 91nm.
Chitosan khi bị xử lý bằng vi sóng cho sản phẩm có MW (khối lƣợng phân tử) thấp hơn và trong phản ứng liên kết ion với TPP cho các hạt nano kích thƣớc nhỏ hơn. Điều này có thể giải thích dƣới tác động của lò vi sóng, chitosan có thể bị phân cắt thành các mạch nhỏ, những mạch chitosan bị cắt này sau đó sẽ tham gia vào phản ứng tạo gel ion với những phân tử TPP. Kết quả là hạt nhỏ đƣợc hình thành. Chitosan không đƣợc xử lý bằng lò vi sóng cũng có thể bị cắt thành các mạch nhỏ dƣới tác dụng của lực khuấy mạnh, tuy nhiên sẽ mất thời gian lâu hơn mới có thể tạo thành các hạt nhỏ hơn.
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa CS và TPP
TPP là một chất tích điện âm và phụ thuộc vào pH, TPP-anions có tới 5 điện tích âm và có thể liên kết chéo với các nhóm amine protonated của CS bằng lực tĩnh điện-hoặc giữa các nhóm của cùng chuỗi polymer (intra-crosslinks) hoặc chuỗi polymers khác nhau (inter-crosslinks) [16]. Tỉ lệ CS:TPP (theo khối lƣợng) có ảnh hƣởng quan trọng đến sự tạo hạt NCS. Do TPP là tác nhân khâu 2 mạch chitosan nên khi nồng độ TPP tăng lên các mạch chitosan bị khâu tăng lên dẫn đến kích thƣớc hạt nano CS/TPP tăng lên, tuy nhiên nếu tỷ lệ này thấp sẽ dẫn đến hiện tƣợng các mạch chitosan thay vì bị khâu mạch sẽ bị trƣợt lên nhau tạo cấu trúc dạng màng không phải dạng hạt.
Để xác định tỉ lệ CS:TPP thích hợp trong phản ứng ionic gelation, tỉ lệ này đƣợc thay đổi lần lƣợt là 4:1, 5:1, 6:1, trong khi nồng độ CS đƣợc giữ cố định là
0,5%(w/v), xử lý CS bằng lò vi sóng 600w / 10 phút, pH= 3-4. Để đáp ứng tỉ lệ CS:TPP lựa chọn, bổ sung TPP 0,5%; 0,4%; 0,3%(w/v).
Khi nhỏ từ từ dung dịch TPP vào dung dịch chitosan, dung dịch huyền phù nano chitosan càng lúc càng trắng đục khi nồng độ TPP tăng lên. Để dung dịch qua đêm thấy ở tỷ lệ CS/TPP là 4:1 thì có hiện tƣợng phân lớp, 2 tỷ lệ còn lại đều thu đƣợc dung dịch đồng nhất nhƣng ở tỷ lệ 5:1 dung dịch đục hơn.
Huang và cs. (2009) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố lên sự hình thành hạt nano chitosan trong phản ứng ionic gelation. Kết quả nhận đƣợc cho thấy, nồng độ dung dịch CS và TPP và khối lƣợng phân tử của CS càng nhỏ thì các hạt tạo thành từ phản ứng CS và TPP có kích thƣớc càng nhỏ. Điều này xảy ra bởi độ bền điện tích (charge stability) của các hạt NCS liên quan với cầu nối hydrogen của các nhóm amino và hydroxyl của CS, và các nhóm hydroxyl và các nguyên tử oxy của nƣớc: sức hút của cầu nối hydrogen càng mạnh, chúng càng sẵn sàng kết tụ lại. [13]
Khi tăng nồng độ TPP, sản phẩm phản ứng thay đổi theo 3 giai đoạn, lỏng trong, trắng sữa và tủa. Khi nồng độ TPP quá thấp, rất ít nhóm phosphate có mặt để tạo sự hấp dẫn tĩnh điện hiệu quả với các nhóm amino của CS, vì vậy dung dịch trong và không có những hạt nano đƣợc tạo thành. Khi lƣợng TPP tăng dần, dung dịch trở thành màu trắng sữa, khi tỉ lệ CS:TPP khoảng 5:1, lúc đó có thể thu đƣợc các hạt NCS. Sau đó, nếu tăng nồng độ TPP dần dần, dịch huyền phù trở nên rõ hơn, và tủa đƣợc tạo thành, có thể do lƣợng TPP trong dung dịch nhiều sẽ làm cho pH của môi trƣờng tăng lên mà tính chất của chitosan có thể bị tủa lại trong môi trƣờng kiềm nên ta thấy hiện tƣợng phân lớp, hơn nữa, khi có quá nhiều TPP, các đầu phosphate của TPP thừa ra có thể tạo nối ngang với nhóm NH2 của các hạt nano chitosan khiến cho các hạt nano chitosan có hiện tƣợng kết dính lại với nhau tạo thành các hạt to hơn, cũng dẫn đến hiện tƣợng dung dịch bị tủa, phân lớp. Kích
Hình 3.3: Dung dịch nano chitosan điều chế từ các tỷ lệ CS/TPP khác nhau (từ trái qua phải): 4:1, 5:1, 6:1
thƣớc của các hạt tạo thành cũng tăng tƣơng ứng (Huang et al., 2009). Kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác cũng cho thấy, khi tỉ lệ CS:TP lớn hơn trong phản ứng ionic gelation, các hạt nano chitosan nhỏ hơn đƣợc tạo ra, với zeta potential thấp hơn [16].
3.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ khuấy và thời gian khuấy lên quá trình tạo hạt nano chitosan
* Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy
CS có cấu trúc khá dài và chắc. Ở trạng thái rắn, phần lớn phân tử ở dạng vòng xoắn ngẫu nhiên, gấp chặt. Những cuộn phân tử riêng biệt cũng không rời rạc và tách ra mà đan vào nhau. Trong dung dịch, dung môi dần khuếch tán vào các khối polymer làm cho chúng trƣơng lên, sau đó các phân đoạn của polymer ngấm dung môi, rời ra thành các cụm phân tử nhỏ hơn. Có thể làm giảm kích thƣớc phân tử CS đến mức hạt nano bằng các quá trình tự lắp ráp hoặc liên kết chéo bởi các tác nhân lý học hoặc tƣơng tác nội phân tử /giữa các phân tử. Trong phản ứng ionic gelation giữa CS và TPP, yếu tố khuấy có tác dụng cắt mạch chitosan một cách cơ học từ dạng sol-gel CS-TPP sang dạng hạt có kích thƣớc nano.
Để xác định ảnh hƣởng của tốc độ khuấy lên kích thƣớc hạt nano CS-TPP trong phản ứng ionic gelation, thí nghiệm đƣợc tiến hành với tỉ lệ CS:TPP là 6:1, khuấy trong 2 giờ. Tốc độ khuấy thay đổi 1500; 4000 và 8000 v/ph . CS đƣợc xử lý trƣớc bằng vi sóng ở 600 w trong 10 phút. Các hạt nano tạo thành đƣợc đo kích thƣớc bằng Zetasizer Ver. 6.20 .(hình 3.4, hình 3.5 và hình 3.6).
Hình 3.5: Sự phân bố kích thƣớc hạt Hình 3.4: Sự phân bố kích thƣớc hạt
Hình 3.4 và 3.5 cho thấy tốc độ khuấy ảnh hƣởng nhiều đến kích thƣớc hạt tạo ra, tốc độ khuấy càng mạnh hạt tạo ra càng nhỏ. Ở điều kiện khuấy 1500 vòng/phút, hạt tạo ra đa số có kích thƣớc lớn khoảng 1305 nm, tuy nhiên kích thƣớc trung bình (Z-Average) lại khá lớn 3411 nm, chứng tỏ vẫn tồn tại những hạt có kích thƣớc lớn hơn 1305 nm. Nhƣng hình ảnh sự phân bố kích thƣớc hạt cho thấy, các hạt có kích thƣớc nhỏ hơn chiếm đa số, các hạt có kích thƣớc lớn hơn 3411 nm số lƣợng không đáng kể. Đối với mẫu thí nghiệm sử dụng tốc độ khuấy 4000 vòng/phút, kích thƣớc