Kiểm tra tính kích ứng của màng BC

4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài

2.2.6. Kiểm tra tính kích ứng của màng BC

Màng BC sau xử lý tiến hành phá nghiền nát màng và thu dịch chiết từ màng BC, sau đó tiến hành tiêm thử nghiệm dưới da thỏ với đối chứng là dung dịch nước muối NaCl 0,9%.

2.2.7. Phương pháp gây bỏng và trị bỏng trên thỏ

Tiến hành nghiên cứu trên thỏ khỏe mạnh từ 1,5 – 2kg, đã ổn định về mặt sinh lý.

Sử dụng đồng xu 200 đồng, nung trên ngọn lửa trong thời gian 3 phút, tiến hành làm bỏng trên phần lưng và đùi của thỏ đã được cạo sạch lông trong vòng 20 giây. Diện tích vết bỏng là 2,367 cm2.

Sau khi gây bỏng 3 ngày cho vết thương hoại tử thì bắt đầu điều trị bỏng, đắp màng BC và gạc lên vết bỏng, sau 24h lại thay màng 1 lần.

Phương pháp tiến hành: chia thành 7 lô thí nghiệm như sau:

Lô 1: Đối chứng, không điều trị Lô 5: Gạc tẩm mật ong Lô 2: BC tẩm nước nghệ tươi Lô 6: Gạc vô trùng

Lô 3: Gạc tẩm nghệ tươi Lô 7: Màng BC sau xử lý Lô 4: BC tẩm mật ong

Phương pháp đánh giá kết quả:

Theo dõi tình trạng vết bỏng, độ phù hoại tử, nhiễm trùng có mủ. Đo diện tích vết bỏng và đánh giá kết quả sau mỗi ngày điều trị.

2.2.8. Phương pháp xử lý bằng thống kê toán học

Sử dụng Excel trong thiết lập biểu đồ

Tính giá trị trung bình cộng tổng thể theo công thức

1 n i i X M n  

Trong đó: M: Giá trị trung bình tổng thể

i

X : Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Một số đặc tính hình thái của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2

Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn trên kính hiển vi quang học

Để quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, tôi tiến hành lấy khuẩn lạc riêng rẽ trong hộp petri làm tiêu bản và tiến hành nhuộm Gram. Đưa lên kính hiển vi quang học (độ phóng đại 1000 lần) và quan sát.

Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hóa dị dưỡng nên khi quan sát trên kính hiển vi nhận thấy tế bào của chúng đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không di động, bắt màu hồng – màu của fucshin. Các tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày.

Hình 3.1. Mẫu tế bào của chủng Acetobacter xylinum BHN2 (Độ phóng đại 1000 lần)

3.2. Quá trình thu nhận màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 xylinum BHN2

3.2.1. Lên men tạo màng

Tôi tiến hành quá trình lên men tạo màng theo các bước sau:  Bước 1: Chuẩn bị giống

Chủng giống thuần do phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp. Sau đó tiến hành nhân giống trên môi trường thạch nghiêng bằng phương pháp cấy chuyền.

Hình 3.2. Chủng Acetobacter xylinum BHN2

 Bước 2: Nhân giống cấp 1

Giống thuần được cấy vào môi trường hoạt hóa giống - nhân giống cấp 1 (2 ống giống/300ml môi trường giống). Sau đó, nuôi lắc trên máy lắc ổn nhiệt 135 vòng/phút trong 24h ở 35oC.

 Bước 3: Lên men tạo màng

Dùng xilanh hút dịch giống cấp 1 vào môi trường lên men (20 ml dịch giống cấp 1/200ml môi trường lên men). Tiến hành lên men tạo màng ở điều kiện tĩnh trong thời gian 7 ngày, quan sát quá trình hình thành màng qua các ngày.

 Bước 4: Thu nhận màng

Tôi tiến hành thu màng qua ngày thứ 3, 4, 5, 6, 7 để đánh giá quá trình hình thành và các đặc tính của màng đã thu nhận.

Hình 3.3. Quá trình thu nhận màng qua các ngày

7 ngày

5 ngày 6 ngày

Khi quan sát hình 3.3, nhận thấy ở điều kiện nhiệt độ phòng từ 20 – 25o C (nghiên cứu được tiến hành trong tháng 4/2012) thì từ ngày th ứ nhất tới ngày thứ 3 có các sợi cellulose bắt đầu được hình thành lơ lửng trong dịch lên men . Sau đó từ ngày thứ 3 và ngày thứ 4 các sợi cellulose này bắt đầu tập hợp lại để tạo thành một lớp màng trắng nổi trên bề mặt dịch lên men và tới ngày thứ 5 thì lớp màng này được nhìn thấy rõ ràng nhất . Tiếp tục quan sát lớp màng này , thấy đến ngày thứ 6 và thứ 7 bắt đầu có hiện tượng màng chìm xuống dưới đáy dịch lên men.

Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Nguyệt khi nghiên cứu màng BC làm mặt nạ dưỡng da [11].

Kết quả nghiên cứu thu được ở bảng 3.3 và hình 3.9:

Bảng 3.1. Đặc tính của màng BC lên men sau 5 ngày

Đặc tính của màng Kết quả

Màu sắc Trắng, tương đối trong suốt

Bề mặt Nhẵn, mịn

Độ dày Từ 0,5mm đến 0,8mm Khối lượng tươi 20g

Vì vậy, tôi quyết định thu màng BC ở ngày thứ 5 và tiến hành các công đoạn tiếp theo.

3.2.2. Xử lý màng sau lên men

Màng BC sau khi lên men được xử lý theo các phương pháp xử lý như đã nói ở phần trên. Qua nghiên cứu, màng BC sau khi được xử lý bước đầu đã đáp ứng được đủ các chỉ tiêu của vật liệu sử dụng trong trị bỏng.

Như vậy, quá trình thu nhận màng BC từ chủng A.xylinum BHN2 cần trải qua 2 quá trình là lên men tạo màng và xử lý màng sau lên men.

Hình 3.5. Màng BC sau khi xử lý

3.3. Lựa chọn phƣơng pháp xử lý bảo quản màng BC

3.3.1. Lựa chọn phương pháp xử lý màng BC

Do màng BC khi được tạo thành có khá nhiều thành phần dư của môi trường bám vào nên mục đích của quá trình xử lý màng là loại bớt các sản phẩm dư, giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt được hiệu quả về mặt cảm quan: màng trắng trong, dai và bền hơn. Song màng BC nghiên cứu ứng dụng chủ yếu trong trị bỏng vì vậy các bước xử lý màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém.

3.3.1.1. Mô hình 1

a. Khả năng ngăn cản vi khuẩn

Khi bị bỏng nếu bị nhiễm khuẩn thì vết bỏng sẽ bị loét rộng, không có khả năng tái sinh mô, khả năng lành vết thương kém hơn,…Vì vậy, một trong các đặc tính của màng BC dùng cho việc trị bỏng là phải có khả năng ngăn cản vi khuẩn, tạo điều kiện trong trị bỏng.

Phương pháp tiến hành: Phủ màng đã xử lý theo mô hình 1 lên hộp petri có chứa môi trường dinh dưỡng, đối chiếu với hộp petri có phủ gạc vô trùng và hộp để ngoài không khí trong thời gian 6 ngày.

Hình 3.6a. Độ pH của màng sau xử lý MH1

Hình 3.6b. Bản thạch đƣợc che phủ bởi màng BC qua xử lý MH1

Qua hình 3.6b nhận thấy trên hộp petri phủ màng BC đã xử lý qua mô hình 1 không có nấm mốc xuất hiện và số khuẩn lạc vi khuẩn mọc ít và ít hơn 2 mẫu còn lại.

Như vậy, màng BC sau xử lý theo mô hình 1 có khả năng ngăn cản vi khuẩn song trong quá trình xử lý vẫn chưa loại bỏ hết vi khuẩn trên màng.

b. Khả năng thấm hút nước của màng BC

Khả năng thấm hút nước là một trong những tiêu chuẩn quan trọng của màng trị bỏng vì khi đắp màng lên vết bỏng màng sẽ thấm hút dịch rỉ của vết thương nhưng vẫn làm vết thương có đủ độ ẩm để tạo điều kiện tái sinh mô.

Phương pháp tiến hành: màng sau xử lý đem sấy khô ở 40o

C trong 24h theo mô hình 1 cân khối lượng (m1) sau đó ngâm màng trong nước trong thời gian 2h, 4h, 6h, 8h, 12h và cân khối lượng màng trong các khoảng thời gian trên.

Bảng 3.2. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý MH1 (g/100cm2)

Mẫu Thời gian (giờ)

0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h Mẫu 1 0,08 1,48 1,83 2,69 3,14 3,35 3,78

Mẫu 2 0,08 2,05 2,95 3,47 3,87 4,27 5,06

M 0 1,68 2,31 3,00 3,43 3,73 4,34

Qua bảng 3.2 ta thấy màng BC sau xử lý mô hình 1 có khả năng thấm hút nước rất tốt, sau 6h khối lượng nước hút vào là 3,00 g/ cm2

đến 12h đã là 4,34 g/cm2.

c. Đặc điểm của màng sau xử lý

Một số tiêu chí để đánh giá màng sau sau xử lý:

Màu sắc: màng BC khi mới tổng hợp từ môi trường lên men có màu hơi đục sau khi được xử lý có màu trắng, việc này hết sức cần thiết đối với vật liệu trị bỏng vì trong quá trình điều trị bỏng cần quan sát và theo dõi tiến trình lành vết thương của vết bỏng.

Mùi vị: màng BC trước khi xử lý có mùi hơi chua của giấm, sau xử lý màng không có mùi.

Độ pH: màng mới tổng hợp từ quá trình nuôi cấy có pH thấp do ở chứa

dịch nuôi cấy có chứa acid acetic. Màng sau xử lý có độ pH trung tính, không gây kích ứng cho da.

Dựa vào những tiêu chí trên tôi tiến hành kiểm tra màng sau xử lý theo mô hình 1. Kết quả được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.3. Đặc điểm của màng sau xử lý MH1

STT Đặc điểm của màng Kết quả

1 Màu sắc Trắng đục

2 Mùi vị Mùi dễ chịu

3 Độ dai Màng dễ rách

Xử lý màng theo mô hình 1 có những ưu, nhược điểm sau:

Ƣu điểm:

Đơn giản, các thao tác dễ thực hiện. Xử lý màng nhanh.

Màng có khả năng chống nấm mốc.

Màng đạt được một số tiêu chí về độ dai, mùi vị.

Nhƣợc điểm:

Chưa loại hết được vi khuẩn bám trên màng. Màng sau xử lý mủn, dễ rách.

3.3.1.2.Mô hình 2

a. Khả năng ngăn cản vi khuẩn

Phương pháp tiến hành tương tự như mô hình 1. Kết quả được thể hiện ở hình 3.7a như sau:

Hình 3.7a. Bản thạch che phủ màng BC qua xử lý MH2

Hình 3.7b. Độ pH của màng sau xử lý MH2

Sau 6 ngày không thấy xuất hiện vi khuẩn, nấm mốc trên hộp phủ màng BC trong khi đó 2 hộp còn lại đều xuất hiện vi khuẩn, nấm mốc.

b. Khả năng thấm hút nước của màng

Phương pháp tiến hành tương tự như mô hình 1

Bảng 3.4. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý MH2 (g/100cm2)

Mẫu Thời gian (giờ)

0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h Mẫu 1 0,08 0,72 0,88 1,35 1,67 2,23 2,55

Mẫu 2 0,08 0,64 0,72 0,78 1,11 1,35 1,83

M 0 0,60 0,72 0,98 1,31 1,71 2,11

Qua bảng 3.4 ta thấy màng sau xử lý theo mô hình 2 có khả năng thấm hút nước khá tốt. Sau 2h khối lượng hút vào là 0,60 g/cm2 sau 6h là 0,985 g/cm2 và đến 12h là 2,11 g/cm2.

c. Đặc tính của màng sau xử lý

Phương pháp tiến hành tương tự như mô hình 1. Kết quả được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 3.5. Đặc điểm của màng sau xử lý theo MH2 (g/100cm2)

STT Đặc điểm của màng Kết quả

1 Màu sắc màng Trắng đục

2 Mùi vị Không mùi

3 Độ dai Dai

4 Độ pH màng 3 - 4

Xử lý màng theo mô hình 2 có ưu, nhược điểm sau:

Ƣu điểm:

Quy trình xử lý đơn giản.

Màng có khả năng ngăn cản vi khuẩn, nấm mốc. Màng có khả năng thấm hút khá tốt.

Nhƣợc điểm:

3.3.1.3.Mô hình 3

a. Khả năng ngăn cản vi khuẩn

Tôi tiến hành thí nghiệm tương tự như mô hình 1 sau 6 ngày không thấy xuất hiện vi khuẩn, nấm mốc trong khi 2 hộp được che phủ gạc vô trùng và không che phủ đều nhiễm vi khuẩn và nấm mốc.

Hình 3.8a. Bản thạch không đƣợc che phủ

Hình 3.8b. Bản thạch đƣợc che đƣợc che phủ bởi gạc vô trùng

Hình 3.8c. Bản thạch che phủ Hình 3.8d. Độ pH của màng sau màng BC qua xử lý MH3 xử lý MH3

b.Khả năng thấm hút nước

Phương pháp tiến hành tương tự như mô hình 1. Kết quả được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.6. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý MH3 (g/100cm2)

Mẫu Thời gian (giờ)

0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h Mẫu 1 0,46 2,51 2,98 3,25 4,24 5,05 6,98

Mẫu 2 0,36 2,44 2,90 3,22 4,10 4,85 5,37

M 0 2,06 2,53 2,82 3,78 4,54 5,76

Màng BC sau khi xử lý qua MH3 có khả năng thấm hút nước rất tốt, sau 8h khối lượng nước hút vào là 3,78 g/cm2, đến 12h đã là 5,76 g/cm2

.

c. Đặc tính của màng sau xử lý

Màng thu được sẽ màng xử lý theo mô hình 3, theo các bước sau:

STT Cách xử lý Kết quả

1 Rửa sạch bằng nước máy nhiều lần.

Loại bỏ bớt acid acetic và các thành phần dư từ môi trường.

2 Đun với nước 100o

C trong 5- 7 phút.

Tẩy trắng màng, giảm vi khuẩn trên màng.

3

Đun với NaOH 0,5N ở 1000C trong thời gian 5-10 phút.

Loại bỏ chất dư thừa và tẩy trắng màng đồng thời làm chết tế bào vi khuẩn trên màng. Màng có màu vàng, mùi khét, dai.

4 Rửa sạch bằng nước máy nhiều lần.

Màng có màu trắng, dai, pH kiềm

5

Trung hoà bằng acid citric loãng và thử lại bằng giấy quỳ.

Bảng 3.7. Đặc tính của màng sau xử lý MH3

STT Đặc điểm của màng Kết quả

1 Màu sắc màng Trắng trong

2 Mùi vị Không mùi

3 Độ dai Dai

4 Độ pH màng 6

Xử lý màng theo mô hình 3 có ưu điểm, nhược điểm sau:

Ƣu điểm:

Phương pháp xử lý hiệu quả.

Màng có khả năng ngăn cản vi khuẩn, nấm mốc tốt.

Màng có khả năng thấm hút nước rất tốt, độ pH trung tính. Màng có độ dai, dày thích hợp làm màng trị bỏng.

Nhƣợc điểm: Quy trình xử lý khá phức tạp.

Sau khi xử lý màng theo 3 mô hình, dựa vào các tiêu chí của màng sau xử lý như khả năng ngăn cản vi khuẩn, khả năng thấm hút nước, các đặc tính của màng,…tôi nhận thấy mô hình là mô hình xử lý màng có hiệu quả nhất vì quy trình xử lý đạt hiệu quả rất tốt màng có khả năng ngăn cản vi khuẩn và thấm hút nước rất tốt, màu trắng trong, pH trung tính,vô khuẩn,…rất thích hợp cho việc điều trị bỏng.

Vì vậy, tôi quyết định sử dụng phương pháp xử lý màng BC theo mô hình 3 cho các nghiên cứu tiếp theo. Cụ thể: đầu tiên rửa nhiều lần với nước máy, tiếp theo đun với nước 100oC trong 5 – 7 phút, sau đó đun với NaOH 0,5N ở 100oC trong 5 – 10 phút, tiếp tục rửa sạch lại với nước máy nhiều lần, cuối cùng trung hòa bằng acid citric loãng.

3.3.2. Lựa chọn phƣơng pháp bảo quản màng BC

Màng BC sau khi đã xử lý cần tiến hành bảo quản để kéo dài thời gian sử dụng và làm đa dạng hóa sản phẩm. Tôi tiến hành theo 2 hướng: sấy khô và kết hợp với ngâm, tẩm với mật ong, dịch nghệ tươi.

3.3.2.1. Phương pháp sấy khô

Hình 3.9. Màng BC đã sấy khô

Màng sau khi được tẩy rửa và khử khuẩn sẽ được sấy khô ở nhiệt độ 40oC trong 24 giờ. Lúc này: màng BC mỏng và rất dai; thời gian bảo quản dài: khoảng 6 tháng, chịu lực tốt hơn màng BC không sấy. Nhưng lưu ý khi dùng phải ngâm, tẩm với nước cất.

3.3.2.2. Bảo quản với chất phụ gia

Màng BC sau khi sấy bớt nước được đem ngâm tẩm với chất phụ gia (mật ong, dịch nghệ) trong thời gian 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng thấm hút của màng BC đối với các chất này. Cụ thể:

Khả năng thấm hút mật ong

Mật ong được biết đến nhiều nhất vì tính sát trùng, kháng sinh và chống nấm. Vì thế nó thường được dùng điều trị cho những vết thương hở. Nó hữu ích khi làm sạch hoặc khử trùng các vết thương và vết bỏng vì có thể hút hơi ẩm từ không khí và đẩy mạnh khả năng làm lành vết thương.

Phương pháp tiến hành tương tự như nghiên cứu khả năng thấm hút của nước. Cân khối lượng màng lần lượt trong các khoảng thời gian 2h, 4h, 6h,