4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
2.1.4. Môi trường nghiên cứu
2.1.4.1. Môi trường giữ giống
Glucose: 20g/l KH2PO4: 2g/l Pepton: 5g/l MgSO4.7H2O: 2g/l Agar: 20g/l Nước máy: 1000ml (NH4)2SO4: 3g/l
2.1.4.2. Môi trường nhân giống
Glucose: 20g/l KH2PO4: 2g/l Pepton: 5g/l MgSO4.7H2O: 2g/l (NH4)2SO4: 3g/l Nước máy: 1000ml
2.1.4.3. Môi trường lên men tạo màng
Glucose: 20g/l MgSO4.7H2O: 2g/l (NH4)2SO4: 3g/l Nước dừa già: 1000ml KH2PO4: 2g/l
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân biệt vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn A.xylinum là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép).
Phương pháp tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn A.xylinum đem nhuộm tiêu bản theo phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần 2 , 3 .
2.2.2. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng sau khi được phân lập được cấy vào ống thạch nghiêng nuôi 4 - 5 ngày trong tủ ấm ở 30oC 3 , 4 . Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4oC dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng hai tháng 1 lần.
2.2.3. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống từ ống thạch nghiêng được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar đem hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24h 3 , 4 .
2.2.4. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110oC trong 20 phút để tránh phân rã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trường 10% giống hoạt hóa. Nuôi cấy tĩnh trong 5 ngày và tiến hành thu màng.
2.2.5. Phương pháp xử lý và bảo quản màng BC
2.2.5.1. Phương pháp xử lý màng BC
Màng sau khi lên men vẫn còn nhiều các chất dư thừa của môi trường, màng có mùi khó chịu. Vì vậy, quá trình xử lý màng là rất cần thiết.
Phương pháp tiến hành: Tôi đưa ra 3 mô hình xử lý màng sau
Mô hình Cách làm
Mô hình 1 Rửa nước 3 lần
Đun sôi với nước trong 30 phút
Mô hình 2
Rửa nước 3 lần
Ngâm cồn 75oC ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Rửa nước 3 lần
Mô hình 3
Rửa nước 3 lần
Đun với nước máy ở 100o
C trong 5 - 7 phút. Đun NaOH 0,5% ở 100o
C trong 5 - 10 phút Rửa nước nhiều lần.
Trung hòa bằng acid citric hoặc nước chanh loãng
Phương pháp đánh giá: Trong mỗi mô hình tôi tiến hành thử khả năng ngăn cản vi khuẩn, khả năng thấm hút nước và các đặc điểm của màng sau xử lý như độ pH, độ dai, màu sắc,…từ đó tôi đưa ra được mô hình xử lý màng BC đem lại hiệu quả cao nhất.
Khả năng ngăn cản vi khuẩn
Khảo sát khả năng ngăn cản vi sinh vật c ủa màng BC so với gạc vô trùng. Tiến hành đ ặt các hộp lồng có chứa môi trường dinh dưỡng và được
che phủ màng BC, gạc vô trùng ở ngoài không khí và hộp lồng chứa môi trường dinh dưỡng mở nắp trong đi ều kiện phòng thí nghiệm trong 24 giờ. Đưa vào tủ ấm 30o
C và quan sát trong những ngày tiếp theo.
Khảo sát khả năng thấm hút nƣớc
Màng BC sau khi được xử lý sẽ sấy khô trong điều kiện 40o
C trong 24 giờ, cân khối lượng màng (m1). Sau đó ngâm màng vào trong nước trong khoảng thời gian xác định là 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h. Vớt màng và cân khối lượng màng trong các khoảng thời gian trên (m2)
M = m2 – m1
M: Khối lượng nước hút vào
2.2.5.2. Phương pháp bảo quản màng BC
Màng BC sau khi xử lý cần được bảo quản để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo và sử dụng để thực nghiệm điều trị bỏng trong thời gian dài mà không làm mất đi các đặc tính sinh học của màng.
Phƣơng pháp sấy khô
Màng sau khi được xử lý sẽ được sấy khô ở nhiệt độ 40o
C trong vòng 24h, sau khi sấy màng sẽ mỏng và dai. Tiếp đó, tiến hành đóng gói bằng máy ép chân không trong các túi nilon ở điều kiện vô trùng.
Bảo quản với chất phụ gia
Khi sấy xong, màng BC sẽ được ngâm tẩm với các chất phụ gia khác nhau trong 12 giờ, sau đó mới đóng gói bằng máy hút chân không.
Phương pháp tiến hành: ngâm tẩm màng với các chất sau: mật ong, nước nghệ tươi, dung dịch nước muối sinh lý 0,9%.
Dụng cụ ngâm tẩm là hộp lồng nhựa, kích thước 10 × 15 cm2, ngâm 1 màng/100ml dung dịch chất phụ gia trong vòng 12 giờ.
Đánh giá bằng cách kiểm tra khả năng thấm hút của màng BC đối với dung dịch phụ gia. Phương pháp tiến hành tương tự như khả năng thấm hút nước.
2.2.6. Kiểm tra tính kích ứng của màng BC
Màng BC sau xử lý tiến hành phá nghiền nát màng và thu dịch chiết từ màng BC, sau đó tiến hành tiêm thử nghiệm dưới da thỏ với đối chứng là dung dịch nước muối NaCl 0,9%.
2.2.7. Phương pháp gây bỏng và trị bỏng trên thỏ
Tiến hành nghiên cứu trên thỏ khỏe mạnh từ 1,5 – 2kg, đã ổn định về mặt sinh lý.
Sử dụng đồng xu 200 đồng, nung trên ngọn lửa trong thời gian 3 phút, tiến hành làm bỏng trên phần lưng và đùi của thỏ đã được cạo sạch lông trong vòng 20 giây. Diện tích vết bỏng là 2,367 cm2.
Sau khi gây bỏng 3 ngày cho vết thương hoại tử thì bắt đầu điều trị bỏng, đắp màng BC và gạc lên vết bỏng, sau 24h lại thay màng 1 lần.
Phương pháp tiến hành: chia thành 7 lô thí nghiệm như sau:
Lô 1: Đối chứng, không điều trị Lô 5: Gạc tẩm mật ong Lô 2: BC tẩm nước nghệ tươi Lô 6: Gạc vô trùng
Lô 3: Gạc tẩm nghệ tươi Lô 7: Màng BC sau xử lý Lô 4: BC tẩm mật ong
Phương pháp đánh giá kết quả:
Theo dõi tình trạng vết bỏng, độ phù hoại tử, nhiễm trùng có mủ. Đo diện tích vết bỏng và đánh giá kết quả sau mỗi ngày điều trị.
2.2.8. Phương pháp xử lý bằng thống kê toán học
Sử dụng Excel trong thiết lập biểu đồ
Tính giá trị trung bình cộng tổng thể theo công thức
1 n i i X M n
Trong đó: M: Giá trị trung bình tổng thể
i
X : Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Một số đặc tính hình thái của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2
Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn trên kính hiển vi quang học
Để quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, tôi tiến hành lấy khuẩn lạc riêng rẽ trong hộp petri làm tiêu bản và tiến hành nhuộm Gram. Đưa lên kính hiển vi quang học (độ phóng đại 1000 lần) và quan sát.
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hóa dị dưỡng nên khi quan sát trên kính hiển vi nhận thấy tế bào của chúng đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không di động, bắt màu hồng – màu của fucshin. Các tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày.
Hình 3.1. Mẫu tế bào của chủng Acetobacter xylinum BHN2 (Độ phóng đại 1000 lần)
3.2. Quá trình thu nhận màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 xylinum BHN2
3.2.1. Lên men tạo màng
Tôi tiến hành quá trình lên men tạo màng theo các bước sau: Bước 1: Chuẩn bị giống
Chủng giống thuần do phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp. Sau đó tiến hành nhân giống trên môi trường thạch nghiêng bằng phương pháp cấy chuyền.
Hình 3.2. Chủng Acetobacter xylinum BHN2
Bước 2: Nhân giống cấp 1
Giống thuần được cấy vào môi trường hoạt hóa giống - nhân giống cấp 1 (2 ống giống/300ml môi trường giống). Sau đó, nuôi lắc trên máy lắc ổn nhiệt 135 vòng/phút trong 24h ở 35oC.
Bước 3: Lên men tạo màng
Dùng xilanh hút dịch giống cấp 1 vào môi trường lên men (20 ml dịch giống cấp 1/200ml môi trường lên men). Tiến hành lên men tạo màng ở điều kiện tĩnh trong thời gian 7 ngày, quan sát quá trình hình thành màng qua các ngày.
Bước 4: Thu nhận màng
Tôi tiến hành thu màng qua ngày thứ 3, 4, 5, 6, 7 để đánh giá quá trình hình thành và các đặc tính của màng đã thu nhận.
Hình 3.3. Quá trình thu nhận màng qua các ngày
7 ngày
5 ngày 6 ngày
Khi quan sát hình 3.3, nhận thấy ở điều kiện nhiệt độ phòng từ 20 – 25o C (nghiên cứu được tiến hành trong tháng 4/2012) thì từ ngày th ứ nhất tới ngày thứ 3 có các sợi cellulose bắt đầu được hình thành lơ lửng trong dịch lên men . Sau đó từ ngày thứ 3 và ngày thứ 4 các sợi cellulose này bắt đầu tập hợp lại để tạo thành một lớp màng trắng nổi trên bề mặt dịch lên men và tới ngày thứ 5 thì lớp màng này được nhìn thấy rõ ràng nhất . Tiếp tục quan sát lớp màng này , thấy đến ngày thứ 6 và thứ 7 bắt đầu có hiện tượng màng chìm xuống dưới đáy dịch lên men.
Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Nguyệt khi nghiên cứu màng BC làm mặt nạ dưỡng da [11].
Kết quả nghiên cứu thu được ở bảng 3.3 và hình 3.9:
Bảng 3.1. Đặc tính của màng BC lên men sau 5 ngày
Đặc tính của màng Kết quả
Màu sắc Trắng, tương đối trong suốt
Bề mặt Nhẵn, mịn
Độ dày Từ 0,5mm đến 0,8mm Khối lượng tươi 20g
Vì vậy, tôi quyết định thu màng BC ở ngày thứ 5 và tiến hành các công đoạn tiếp theo.
3.2.2. Xử lý màng sau lên men
Màng BC sau khi lên men được xử lý theo các phương pháp xử lý như đã nói ở phần trên. Qua nghiên cứu, màng BC sau khi được xử lý bước đầu đã đáp ứng được đủ các chỉ tiêu của vật liệu sử dụng trong trị bỏng.
Như vậy, quá trình thu nhận màng BC từ chủng A.xylinum BHN2 cần trải qua 2 quá trình là lên men tạo màng và xử lý màng sau lên men.
Hình 3.5. Màng BC sau khi xử lý
3.3. Lựa chọn phƣơng pháp xử lý bảo quản màng BC
3.3.1. Lựa chọn phương pháp xử lý màng BC
Do màng BC khi được tạo thành có khá nhiều thành phần dư của môi trường bám vào nên mục đích của quá trình xử lý màng là loại bớt các sản phẩm dư, giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt được hiệu quả về mặt cảm quan: màng trắng trong, dai và bền hơn. Song màng BC nghiên cứu ứng dụng chủ yếu trong trị bỏng vì vậy các bước xử lý màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém.
3.3.1.1. Mô hình 1
a. Khả năng ngăn cản vi khuẩn
Khi bị bỏng nếu bị nhiễm khuẩn thì vết bỏng sẽ bị loét rộng, không có khả năng tái sinh mô, khả năng lành vết thương kém hơn,…Vì vậy, một trong các đặc tính của màng BC dùng cho việc trị bỏng là phải có khả năng ngăn cản vi khuẩn, tạo điều kiện trong trị bỏng.
Phương pháp tiến hành: Phủ màng đã xử lý theo mô hình 1 lên hộp petri có chứa môi trường dinh dưỡng, đối chiếu với hộp petri có phủ gạc vô trùng và hộp để ngoài không khí trong thời gian 6 ngày.
Hình 3.6a. Độ pH của màng sau xử lý MH1
Hình 3.6b. Bản thạch đƣợc che phủ bởi màng BC qua xử lý MH1
Qua hình 3.6b nhận thấy trên hộp petri phủ màng BC đã xử lý qua mô hình 1 không có nấm mốc xuất hiện và số khuẩn lạc vi khuẩn mọc ít và ít hơn 2 mẫu còn lại.
Như vậy, màng BC sau xử lý theo mô hình 1 có khả năng ngăn cản vi khuẩn song trong quá trình xử lý vẫn chưa loại bỏ hết vi khuẩn trên màng.
b. Khả năng thấm hút nước của màng BC
Khả năng thấm hút nước là một trong những tiêu chuẩn quan trọng của màng trị bỏng vì khi đắp màng lên vết bỏng màng sẽ thấm hút dịch rỉ của vết thương nhưng vẫn làm vết thương có đủ độ ẩm để tạo điều kiện tái sinh mô.
Phương pháp tiến hành: màng sau xử lý đem sấy khô ở 40o
C trong 24h theo mô hình 1 cân khối lượng (m1) sau đó ngâm màng trong nước trong thời gian 2h, 4h, 6h, 8h, 12h và cân khối lượng màng trong các khoảng thời gian trên.
Bảng 3.2. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý MH1 (g/100cm2)
Mẫu Thời gian (giờ)
0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h Mẫu 1 0,08 1,48 1,83 2,69 3,14 3,35 3,78
Mẫu 2 0,08 2,05 2,95 3,47 3,87 4,27 5,06
M 0 1,68 2,31 3,00 3,43 3,73 4,34
Qua bảng 3.2 ta thấy màng BC sau xử lý mô hình 1 có khả năng thấm hút nước rất tốt, sau 6h khối lượng nước hút vào là 3,00 g/ cm2
đến 12h đã là 4,34 g/cm2.
c. Đặc điểm của màng sau xử lý
Một số tiêu chí để đánh giá màng sau sau xử lý:
Màu sắc: màng BC khi mới tổng hợp từ môi trường lên men có màu hơi đục sau khi được xử lý có màu trắng, việc này hết sức cần thiết đối với vật liệu trị bỏng vì trong quá trình điều trị bỏng cần quan sát và theo dõi tiến trình lành vết thương của vết bỏng.
Mùi vị: màng BC trước khi xử lý có mùi hơi chua của giấm, sau xử lý màng không có mùi.
Độ pH: màng mới tổng hợp từ quá trình nuôi cấy có pH thấp do ở chứa
dịch nuôi cấy có chứa acid acetic. Màng sau xử lý có độ pH trung tính, không gây kích ứng cho da.
Dựa vào những tiêu chí trên tôi tiến hành kiểm tra màng sau xử lý theo mô hình 1. Kết quả được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.3. Đặc điểm của màng sau xử lý MH1
STT Đặc điểm của màng Kết quả
1 Màu sắc Trắng đục
2 Mùi vị Mùi dễ chịu
3 Độ dai Màng dễ rách
Xử lý màng theo mô hình 1 có những ưu, nhược điểm sau:
Ƣu điểm:
Đơn giản, các thao tác dễ thực hiện. Xử lý màng nhanh.
Màng có khả năng chống nấm mốc.
Màng đạt được một số tiêu chí về độ dai, mùi vị.
Nhƣợc điểm:
Chưa loại hết được vi khuẩn bám trên màng. Màng sau xử lý mủn, dễ rách.
3.3.1.2.Mô hình 2
a. Khả năng ngăn cản vi khuẩn
Phương pháp tiến hành tương tự như mô hình 1. Kết quả được thể hiện ở hình 3.7a như sau:
Hình 3.7a. Bản thạch che phủ màng BC qua xử lý MH2
Hình 3.7b. Độ pH của màng sau xử lý MH2
Sau 6 ngày không thấy xuất hiện vi khuẩn, nấm mốc trên hộp phủ màng BC trong khi đó 2 hộp còn lại đều xuất hiện vi khuẩn, nấm mốc.
b. Khả năng thấm hút nước của màng
Phương pháp tiến hành tương tự như mô hình 1
Bảng 3.4. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý MH2 (g/100cm2)
Mẫu Thời gian (giờ)
0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h Mẫu 1 0,08 0,72 0,88 1,35 1,67 2,23 2,55
Mẫu 2 0,08 0,64 0,72 0,78 1,11 1,35 1,83
M 0 0,60 0,72 0,98 1,31 1,71 2,11
Qua bảng 3.4 ta thấy màng sau xử lý theo mô hình 2 có khả năng thấm hút nước khá tốt. Sau 2h khối lượng hút vào là 0,60 g/cm2 sau 6h là 0,985 g/cm2 và đến 12h là 2,11 g/cm2.
c. Đặc tính của màng sau xử lý
Phương pháp tiến hành tương tự như mô hình 1. Kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.5. Đặc điểm của màng sau xử lý theo MH2 (g/100cm2)