4. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn
Phương pháp nhỏ dịch
Nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường Gause I, 160 vòng/ phút trong 3 ngày. Sau đó li tâm 4000 vòng/phút loại sinh khối. Nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào lỗ thạch trong đĩa petri trong môi trường chứa cơ chất và thạch. Để hộp lồng vào trong tủ lạnh 4h, sau đó nuôi trong tủ ấm 2 ngày. Thử hoạt tính bằng
32
thuốc thử rồi đo vòng phân giải. Xác định hoạt tính cellulase bằng môi trường chứa 1% CMC và bột giấy, thử bằng thuốc thử Lugol I.
Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bị môi trường thạch đĩa chứa 1% CMC hoặc bột giấy. Dùng que cấy chấm nhẹ vào khuẩn lạc sau đó chấm nhẹ một điểm xuống bề mặt thạch đĩa. Nuôi khuẩn lạc trong tủ ấm sau 4 ngày mang ra thử hoạt tính với thuốc thử Lugol I, đo kích thước vòng phân giải.
33
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập xạ khuẩn từ đất trồng
Tiến hành phân lập các mẫu đất ở các độ sâu khác nhau theo thứ tự 0cm, 5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm trên 3 môi trường: Gause I, Czapeck- glucose, Czapeck- Tinh bột. Kết quả trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng STT Độ sâu Độ pha loãng Môi trƣờng Gause I Czapeck- glucose Czapeck- Tinh bột 1 0 cm 10-5 10-6 T1 2 5 cm 10-5 T2 T15 10-6 3 10 cm 10-5 T3 10-6 T4,T5 4 15 cm 10-5 T6, T7, T8 10-6 T9, T10, T11 T16 5 20 cm 10-5 T12 10-6 T17 T18 6 25 cm 10-5 T13 10-6 7 30 cm 10-5 T14 T19 10-6
Trên 3 môi trường Gause I, Czapeck - glucose, Czapeck- tinh bột cả xạ khuẩn, nấm mốc và một số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân giải cellulose. Nhưng có thể phân biệt các khuẩn lạc này: Khuẩn lạc vi khuẩn thường nhày, ướt và nhẵn. Khuẩn lạc nấm mốc cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc xạ khuẩn nhưng khác ở chỗ nó phát triển nhanh và to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần. Khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông, xốp, khô, rắn chắc, xù xì, nếu không có HSKS thì khuẩn lạc có dạng
34
màng dẻo. Sau 3 ngày phát triển khuẩn lạc xạ khuẩn có kích thước khoảng 0,5- 2mm. Qua kết quả phân lập xạ khuẩn từ đất trồng tại Xuân Hòa- Phúc Yên- Vĩnh Phúc thu được kết quả sau:
Ở độ sâu 5cm, 10cm, 15cm và môi trường Gause I phân lập được nhiều xạ khuẩn nhất. Xạ khuẩn là loại VSV hoại sinh, hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 25- 30oC, độ ẩm thích hợp từ 40-50%, pH trung tính hoặc kiềm nhẹ. Ở độ sâu 5cm, 10cm, 15cm có những điều kiện tối ưu như: cường độ ánh sáng vừa phải, nhiệt độ tương đối ổn định, xác hữu cơ được tích tụ và phân giải dưới tác động của nhiều nhóm VSV tạo thành các chất hữu cơ trung gian và hàm lượng oxi hòa tan khá cao, ngoài ra các điều kiện về độ ẩm, độ pH... đều thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển của xạ khuẩn nên ta phân lập được nhiều xạ khuẩn ở ba độ sâu này.
Môi trường Gause I có thành phần môi trường thích hợp nhất với sự phát triển của xạ khuẩn nên khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên môi trường này nhiều hơn trên 2 môi trường Czapeck - glucose và Czapeck- tinh bột, vì thế ta phân lập được nhiều xạ khuẩn từ môi trường này.
35
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
Tiến hành nghiên cứu đặc điểm HSKS, HSCC... của các chủng xạ khuẩn đã phân lập được. Nuôi cấy các chủng này trên môi trường Gause I, sau 3-5 ngày đem quan sát. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
STT Chủng xạ khuẩn Màu sắc khuẩn lạc HSKS HSCC 1 T1 Trắng Nâu nhạt 2 T2 Xám Xám Xanh 3 T3 Nâu Vàng 4 T4 Hồng Vàng Ôliu 5 T5 Hồng Đỏ gạch 6 T6 Trắng Vàng ôliu 7 T7 Xám Vàng 8 T8 Hồng Xám 9 T9 Trắng Không có
10 T10 Xanh da trời Xanh đậm
11 T11 Trắng Vàng 12 T12 Nâu Vàng xám 13 T13 Xanh Xanh nhạt 14 T14 Trắng Xám Xanh 15 T15 Hồng Xanh 16 T16 Nâu Nâu 17 T17 Hồng Vàng xỉn 18 T18 Xám Vàng xỉn
Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập chủ yếu có dạng xù xì hoặc dạng bẹt, có kích thước khá nhỏ so với khuẩn lạc của các loài VSV khác, khoảng 0,5 – 2mm. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hướng sinh trưởng trong môi trường tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trường tạo ra HSKS. Màu sắc của HSKS và HSCC rất đa dạng và phong phú: vàng, nâu, xám, hồng, xanh... Và đây là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn, nhờ vào đó ta có thể xác định xạ khuẩn được phân lập thuộc chi nào, họ nào, ngành nào...
36
Căn cứ vào kết quả thu được chúng tôi đưa ra một số nhận xét sau:
Đất là môi trường tốt nhất cho xạ khuẩn phát triển; Cùng một loại đất ở các độ sâu khác nhau sự phân bố của xạ khuẩn là khác nhau; Chúng tôi đã phân lập được 18 chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase khá mạnh. Trong đó 4 chủng có hoạt tính cellulase mạnh nhất là T5, T7, T9, T13. Từ đó chúng tôi đã lựa chọn 4 chủng này để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
a b c
d e f
Hình 3.2.Một số hình ảnh xạ khuẩn
a, b. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn phân lập được
c, d, e, f. Hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn nghiên cứu
3.3. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. nghiên cứu.
Tôi tiến hành nuôi cấy bốn chủng T5, T7, T9, T13 trên môi trường Gause- I để quan sát khả năng sinh trưởng của chúng và màu sắc của hệ khuẩn ty. Kết quả cho thấy tùy từng chủng xạ khuẩn khác nhau mà màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh và sắc tố hòa tan là khác nhau:
37
Chủng T5: HSKS màu hồng, HSCC màu đỏ gạch ,sắc tố tan màu hồng nhạt, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24- 48h, cuống sinh bào tử có dạng xoắn.
Chủng T7: HSKS màu xám, HSCC màu vàng, sắc tố tan vàng nhạt, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24- 48h, cuống sinh bào tử dạng xoắn thẳng.
Chủng T9: HSKS màu trắng, không có HSCC, sắc tố tan màu trắng đục, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24- 48h, cuống sinh bào tử thẳng có móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
Chủng T13: HSKS màu xanh, HSCC màu xanh nhạt, sắc tố tan màu xanh nhạt, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24- 48h, cuống sinh bào tử có dạng thẳng lượn sóng.
a b c
d e f
Hình 3.3. Hình ảnh hệ sợi và cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
a,b. Hệ sợi của xạ khuẩn
c, d, e, f. Cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn T5, T7, T9, T13 tương ứng được nghiên cứu
38
Bào tử của xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh – gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn. Hình thái cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [9]. Tuy nhiên, số lượng bào tử và hình dạng của chuỗi là khác nhau ở các đơn vị phân loại khác nhau.
Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein
với độ dày khoảng 300 – 400 A0
chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi từ ngoại cảnh như nhiệt độ, pH… Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn [13].
3.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
3.4.1. Khả năng chịu muối
Bốn chủng T5, T7, T9, T13 được nuôi cấy trong môi trường Gause –I có bổ sung NaCl ở các nồng độ 0,5; 2; 4; 6; 10; 14 và 0% đối chứng. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.3. Khả năng chịu muối của 4 chủng T5, T7, T9, T13
NaCl (%) Chủng 0,5 2 4 6 10 14 0 T5 +++ +++ ++ ++ + + - T7 +++ ++ + + + - - T9 +++ + ++ + + - - T13 +++ ++ ++ + + - -
Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường +: Sinh trưởng yếu; - : Không sinh trưởng
39
Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn. Kết quả trình bày trên bảng 3.3 cho thấy: Cả 4 chủng đều có khả năng sử dụng nồng độ muối tới 10%. Ở nồng độ muối cao hơn (14%) 3 chủng T7, T9, T13 không có khả năng sinh trưởng. Tuy nhiên chủng T5 vẫn có khả năng sinh trưởng nhưng yếu ở nồng độ muối này.
Như vậy nồng độ muối 0,5% có tác dụng kích thích xạ khuẩn sinh trưởng . Kết quả nghiên cứu này của tôi cũng phù hợp với kết quả của các tác giả khác như Bùi Thị Hà (2008), nghiên cứu khả năng chịu muối của hai chủng xa khuẩn Đ1 và R2 nghiên cứu.
Các muối vô cơ là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với sự sinh trưởng của VSV. Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần trung tâm hoạt tính các enzyme của VSV, duy trì tính ổn định kết cấu các đại phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào, khống chế điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinh năng lượng đối với một số loài VSV. Tùy từng loài VSV mà chúng sử dụng muối ở các nồng độ khác nhau (khoảng 2 – 5%) không quá cao cũng không quá thấp. Nếu ở nồng độ muối quá cao thì hoạt tính sinh lý của VSV bị giảm sút, thậm chí ngừng sinh trưởng.
3.4.2. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon
Nguồn cacbon là nguồn vật chất cung cấp C trong quá trình sinh trưởng của VSV. Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. C có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào. Đồng thời hầu hết các nguồn C trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bào nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của VSV. Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn C. Đường nói chung là nguồn
40
C và nguồn năng lượng tốt cho vi sinh vật. Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau.
Để đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau, tôi tiến hành nuôi cấy 4 chủng T5, T7, T9, T13 trên môi trường Czapeck- glucose có thay đổi các nguồn đường khác nhau. Sau 7-14 ngày nuôi cấy, kết quả được trình bày trên bảng 3.4:
Bảng 3.4. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 4 chủng xạ khuẩn T5, T7, T9, T13
Nguồn Cacbon Mức độ sinh trƣởng
Chủng T5 Chủng T7 Chủng T9 Chủng T13
Glucose ++++ ++++ ++++ ++++
Saccharose +++ + ++ +++
Mantose +++ ++ + -
Fructose + +++ - ++
Ghi chú: ++++: Sinh trưởng rất tốt; +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng yếu; +: Sinh trưởng rất yếu -: Không sinh trưởng
Qua kết quả trên bảng 3.4 cho thấy:
Cả 4 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều có khả năng đồng hóa tốt các nguồn cacbon khác nhau. Chủng T5 đồng hóa tốt nhất glucose, saccharose, mantose và sinh trưởng yếu trong môi trường chứa nguồn cacbon fructose. Chủng T7 sinh trưởng tốt trong môi trường chứa nguồn cacbon glucose,
mantose, fructose và sinh trưởng yếu trong môi trường chứa nguồn cacbon saccharose. Chủng T13 sinh trưởng tốt trên môi trường chứa nguồn cacbon glucose, saccharose, fructose nhưng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa nguồn cacbon mantose.
41
3.4.3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào.
Hiện nay, việc phân hủy các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó việc xử lý các chất thải hữu cơ bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme ngoại bào từ VSV có nhiều ưu điểm về cả mặt kĩ thuật, kinh tế và môi trường. Trong quá trình sống, để phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản có thể hấp thu được. Xạ khuẩn có khả năng tiết ra môi trường các enzyme ngoại bào. Từ đó tôi tiến hành kiểm tra khả năng này của 4 chủng xạ khuẩn nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 4 chủng xạ khuẩn T5, T7, T9, T13
Enzyme
Chủng Cellulase Protease Amylase
T5 + + +
T7 + + +
T9 + - +
T13 + + +
Ghi chú: +: có hoạt tính - không có hoạt tính
Cơ chất CMC – cellulase Cơ chất bột sữa- protease Cơ chất TBT- amylase Hình 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng T5
Kết quả cho thấy cả 4 chủng đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào, trong đó mạnh nhất là hoạt tính enzyme cellulase thủy phân cơ chất CMC.
42
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn.
3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Cacbon là một trong những nguồn dinh dưỡng không thể thiếu đối với đời sống của bất kì loài sinh vật nào, nguồn cacbon này tồn tại ở nhiều dạng khác nhau từ các hợp chất vô cơ đơn giản (CO2) đến các hợp chất vô cơ phức tạp (đường, các polisaccharide...). Cellulose là nguồn cacbon chủ yếu trong tự nhiên, lượng cellulose này phần lớn từ rác thải (thân, lá, rễ thực vật, rác thải công nghiệp...). Để đồng hóa được lượng cellulose khổng lồ này đòi hỏi các chủng xạ khuẩn nói riêng và các VSV nói chung phải có khả năng tổng hợp
cellulase.
Sự phát triển của công nghệ sinh học, người ta bắt đầu nghĩ đến việc tận dụng các nguồn cellulose trong phế thải (bã ngô, bã đậu, bã mía, vỏ lạc, vỏ trấu...) để sản xuất các loại thức ăn cho gia súc. Đây là một nguồn phế thải nông nghiệp khá dồi dào hầu như chưa được tận dụng. Để tìm ra chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, tôi tiến hành nuôi cấy 4 chủng xạ khuẩn T5, T7, T9, T13 trong các môi trường chứa nguồn cacbon tự nhiên là lõi ngô, rơm rạ, bã mía từ đó tìm ra các chủng có hoạt tính cellulase cao ứng dụng và đời sống sản xuất.
43
Tôi tiến hành cấy các chủng xạ khuẩn T5, T7, T9, T13 lần lượt trong các môi trường lỏng chứa lõi ngô, rơm rạ, bã mía. Nuôi lắc ổn nhiệt ( 30o
C, 160v/p) trong 4 ngày rồi li tâm thu lượng enzyme thô, đem thử hoạt tính
cellulase bằng phương pháp nhỏ dịch. Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Chủng Cơ chất T5 T7 T9 T13 Lõi ngô 30 26 25 30 Rơm rạ 35 25 28 22 Bã mía 27 20 24 28
Hoạt tính enzyme: D-d Đơn vị: mm
Hình 3.6. Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn trên môi chứa nguồn cacbon tự nhiên.
Từ bảng trên ta nhận thấy cả 4 chủng đều có hoạt tính enzyme cellulase mạnh trên cả ba môi trường . Trong đó ở môi trường rơm rạ chủng T5 và T13 phát triển mạnh nhất . Ở môi trường lõi ngô 2 chủng T7 và T13 phát triển mạnh nhất. Trong 4 chủng trên thì chủng T5 và T13 có khả năng sinh trưởng và phát triển đồng đều trong các môi trường chứa nguồn cacbon