Hệ thống cellulase - Ý nghĩa lí luận và thực tiễn- 123docz.net

4. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài

1.4.2. Hệ thống cellulase

Để có thể phân giải được cellulose tự nhiên cần phải có sự hiệp trợ của các enzyme trong phức hệ cellulase . Phức hệ cellulase bao gồm 3 loại enzyme chủ yếu:

Endoglucanase (EC.3.2.1.4. β-Dglucan - glucanolhydrolase hay Carboxymethylcellulase viết tắt là CMCase): có khả năng cắt đứt các liên kết bên trong phân tử cellulose làm giảm nhanh chiều dài chuỗi nhưng đường khử tăng chậm do chúng thuỷ phân liên kết β - 1,4glucozid một cách tuỳ tiện trong mạch cellulose và giải phóng cellulodextrin, cellobiose. Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose hoà tan, nhất là dạng cellulose vô định hình nhưng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh. Enzyme này được cho là enzyme Cx. Chính nhờ sự cắt trước của endoglucanase đã tạo ra các đầu không khử , tạo điều kiện dễ dàng cho cellobiohydrolase do đó mà thuỷ phân hoàn toàn được cellulose kết tinh.

Exoglucanase (EC.3.2.1.91. 1,4 β - glucan – celobiohydrolase viết tắt là CBH). Enzyme này xúc tác tách liên tiếp các phân tử cellulose từ đầu khử (CBHI) và đầu không khử (CBHII) của chuỗi cellulose. Ngày nay nó được coi là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi nó có khả năng phân cắt cellulose ở cả vùng kết tinh. Hoạt tính của enzyme này rất mạnh khi tác động lên vùng vô định hình và cellulose đã bị phân giải một phần bởi endoglucanase. Bởi vậy, khi kết hợp endoglucanase với exoglucanase hoạt tính phân giải tăng rõ rệt.

CBH tác động rất kém lên CMC, nhưng có thể cắt được CMC khi nó đã bị trương lên một phần. Các sợi bông có cấu trúc chắc chắn bởi các nối tương tác hydro và mức độ polyme hoá cao (>10000 glucose) thì CBH phân giải cũng chậm, bởi vì bông cũng có một ít đầu khử tự do. Tuy nhiên CBH có thể

cắt tốt nhất Avicel, một loại cellulose có các mối liên kết hydro chắc chắn, song mức độ polyme hoá thấp (< 200 gốc glucose).

β - 1,4 glucosidase (EC3.2.21 β - 1,4 glucosidase hay cellobiase): là enzyme rất đặc hiệu, có khả năng thuỷ phân cellobiose hay các celloligosacarit hoà tan trong nước giải phóng glucose. Enzyme này có hoạt tính cực đại trên cellobiose và có hoạt tính giảm dần theo chiều dài của chuỗi cellulodextrin. Chức năng của β - 1,4 glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích luỹ các chất cảm ứng của cellulase.

Hình 1.3. Tác dụng của từng enzyme trong hệ thống cellulase 1.4.3. Cơ chế phân giải cellulose

Reese và các cộng sự lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải vào năm 1952 như sau:

Theo tác giả này thì enzyme C1 ( tương ứng với exoglucanase ) là “tiền nhân tố thuỷ phân” hay là enzyme không đặc hiệu, làm biến dạng cellulose tự nhiên thành chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn. Sau đó enzyme Cx (tương ứng với endoglucanase) tiếp tục phân cắt, giải phóng các đường hoà

Glucose Cellulose tự nhiên Cellulose hoạt động Đƣờng hòa tan C1 Cx Cellobiase

tan cellodextrin và cellobiose, cuối cùng cellobiose bị cắt tạo thành glucose dưới tác dụng của cellobiase.

Erickson và cộng sự, 1973 lại có quan điểm khác, thể hiện trên một sơ đồ phức tạp hơn nhiều về quá trình thuỷ phân cellulose ( Hình 1.4 )

Hình 1.4. Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973

Đầu tiên, exoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt đứt các liên kết β - 1,4 glucozid để tạo ra các mạch tự do. Tiếp đó, dưới tác dụng của endoglucanase từ phía cực kín (phía không có tính khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose. Cuối cùng β-1,4 glucosidase thuỷ phân một phần cellodextrin và cellobiose thành glucose.

Năm 1977, Tuula T.T, đã đưa ra một sơ đồ khác về cấu tạo của cellulose và tác động của cellulase. Theo ông cellulose là một polyme tự nhiên cho nên sự kết tinh cũng không hoàn hảo. Các vùng vô định hình xen

Cellulose tự nhiên

Cellulose vô định hình không có cấu trúc lớp ( dạng hoạt động ) Disaccharide ( cellobiose ) Glucose Exo glucanase Endo glucanase Exo glucanase β - glucosidase

kẽ với các vùng kết tinh một cách tự nhiên. Các vùng vô định hình có thể ở trên bề mặt sợi cellulose hoặc ở ngay dưới vùng kết tinh hoàn hảo nhất. Các loại cellobiohydrolase (CBH) sẽ tấn công vào các vùng kết tinh và các mạch bị cắt dở dang có các đầu khử hoặc không khử (CBHI tấn công vào đầu khử còn CBHII tấn công vào đầu không khử) lần lượt tách các cellobiose ra khỏi chuỗi polyme. Khả năng làm giảm mức polyme hoá của exoglucanase chậm song hàm lượng đường khử lại tạo ra nhiều. trong khi đó endoglucanase phân cách mạch polyme tuỳ tiện, không theo trật tự nào, tạo ra các chuỗi oligosaccarid ngắn, dẫn đến giảm nhanh mức polyme hoá của cellulose. Trong quá trình cắt gẫy mạch polyme, endoglucanase tạo ra các đầu khử và không khử tự do, tạo cơ hội cho CBH phân cách thành cellobiose. Bởi vậy, khi có tổ hợp endo - exoglucanase quá trình phân giải cellulose mạnh lên nhiều. Tính chất và cấu trúc cũng như những thay đổi của cơ chất trong quá trình thuỷ phân đều tác động đến vận tốc phân cắt của enzyme. Hiệu ứng này đã được nghiên cứu trên quan điểm cơ chế phản ứng.

Tổng hợp các yếu tố cấu trúc, sự hấp thụ của cellulase, sự kìm hãm của sản phẩm và sự vô hoạt của cellulase, tất cả đều có ảnh hưởng quan trọng đến vận tốc thuỷ phân cellulose. Nói chung cho đến nay chưa có giả thuyết nào giải thích được thật đầy đủ và thoả đáng về cơ chế tác động của cellulose. Tuy nhiên, công nghệ và giải pháp thiết bị để chuyển hoá cellulase bằng con đường công nghệ sinh học thì hiện nay nhiều nước trên thế giới đã đưa vào triển khai ở quy mô công nghệ và đã thu được nhiều kết quả.

1.4.4. Ứng dụng của cellulase

Nguồn cơ chất để cellulase phân giải là vô cùng phong phú và đa dạng trong tự nhiên cũng như trong đời sống sinh hoạt.

Hàng ngày, một lượng lớn chất thải lignocellulose từ nông nghiệp, công nghiệp, đô thị luôn chồng chất hoặc sử dụng chúng một cách kém hiệu quả do

giá thành của quy trình xử lí rác thải rất cao. Điều này trở thành vấn đề quan trọng hàng đầu với sinh thái, công nghiệp hoá học và công nghệ sinh hoc. Hơn nữa, đây còn là vấn đề kinh tế đáng quan tâm trong việc phát triển quy trình tái sử dụng cho hiệu quả và lợi dụng chất thải cellulose như là nguồn cơ chất rẻ tiền. Cellulase là phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Trong hiện tại và tương lai người ta sử dụng cellulase cho mục đích chính:

Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghệ thực phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc và trong công nghệ môi trường. Thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau.

Các lĩnh vực chính ứng dụng cellulase bao gồm:

Công nghệ chế biến thực phẩm

+ Cải thiện độ tiêu hoá thức ăn

+ Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protin từ rau quả

+ Cải thiện độ hoà tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men + Sản xuất rượu và một số axit hữu cơ

Công nghệ dược phẩm

+ Cải thiện độ tiêu hoá rơm, cỏ làm thức ăn gia súc + Sảm xuất thức ăn giàu protein

Công nghệ môi trường

+ Ứng dụng trong xử lý phế liệu sau thu hoạch, xử lý rác đô thị, phân huỷ thành phân bón hữu cơ

+ Phân huỷ các chất tồn lưu, trong đó có DDT, TNT.

Công nghệ lên men

+ Cung cấp cơ chất cho tổng hợp khí metan, glyxerin, axit xitric, axit lactic, vitamin, protein đơn bào, chất kháng sinh, các chất có hoạt tính sinh học khác.

Ngoài ra, trong giao thông vận tải, từ sinh khối cellulose sản xuất ra etanol là nhiên liệu tuyệt vời cho động cơ đốt trong và nó có thể thay thế cho nhiên liệu hoá thạch để giảm bớt sự ô nhiễm môi trường và sự nóng lên toàn cầu ( Philippidis và Smith, 1995).

Trong công nghệ dệt may, người ta thấy nếu dùng cellulase ở liều thấp để xử lý bông sẽ làm bông trắng và mịn màng hơn, do nó loại bỏ được các sợi và các hạt trên bề mặt sợi bông làm cho sợi phẳng, bóng mượt và mềm. Hoặc có thể dùng cellulase (các loại cellulase trung tính) để mài vải quần áo bò thay thế cho mài bằng đá bọt để tạo ra những điểm “bạc” tự nhiên của quần áo bò. Điều này có ý nghĩa rất lớn với ngành công nghiệp mài vải bò vì khi xử lý bằng cellulase làm cho vải bò mềm hơn nhiều, nó không phá cấu trúc của vải mạnh như đá mài, hơn nữa khối lượng mài một mẻ tăng lên 50% do đã loại bỏ 50% thể tích đá bọt phải bổ sung vào vải ở thùng mài.

Trong công nghệ sản xuất bột giấy, giấy sử dụng cellulase để tẩy mực trên các giấy phế thải thay thế dùng Cl hoặc ClO2 gây ô nhiễm môi trường. Để làm sạch, trắng giấy người ta sử dụng chủ yếu là loại hemicellulase, xylanase từ Sporotricchum pulverulentum, S. dimorphosphorum, cellulase từ

A. niger hoặc từ Phanerochaeta chrysosporiym, hoặc mannase từ T. reesei. Cellulase thường được dùng ở (0.001 ÷ 0.1%), cellulase (0.05 ÷ 0.5%), Cellobiase (0.005 ÷ 0.015%).

Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa. Tác dụng của cellulase trong chất tẩy rửa chủ yếu là loại bỏ các sợi hỏng, làm cho vải trở lên mịn đẹp, mềm sáng đẹp hơn. Cellulase thường được sử dụng kết hợp với lipase (loại bỏ mỡ) và protease (loại bỏ protein). Các enzyme này dùng cho chất giặt đều là các enzyme trung tính hoặc kiềm.

Cellulase còn được sử dụng hiệu quả để phá vỡ thành tế bào thực vật trong công nghệ lai ghép tế bào trần - một công nghệ lai tế bào giữa các loài

hoặc thậm chí giữa các chi khác nhau tạo giống cây trồng mới trong nông nghiệp.

* Ứng dụng của cellulase trong chăn nuôi

Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức cao nhất. Trong nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ sung vào khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hoá sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn giúp cho con vật tiêu hoá được tốt hơn.

Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme này mà thường bổ sung với các enzyme khác như: amylase, protease, xylanase…tạo ra một dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme (multienzyme). Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ chất, vật nuôi sẽ hấp thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau.

Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hoá của chúng chưa hoàn chỉnh, chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ. Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6 ÷ 14%. Thí nghiệm trên lợn 1 ÷ 3 tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8 ÷ 40%, tăng khả năng sử dụng thức ăn từ 10 ÷ 18% [16].

Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò. Quá trình tiêu hoá thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò được gắn liền với hoạt động enzyme của các vi sinh vật sống nhờ đấy. Vì vậy, bổ sung vào thức ăn những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hoá là điều rất cần thiết.

Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase…..đều thu được kết quả tốt, khả năng tăng trọng của trâu bò có thể đạt tới 12 ÷ 17%, có khi còn cao hơn [17], [18].

Trên thế giới người ta sử dụng thức ăn gia súc có chứa các enzyme tiêu hoá từ đầu những năm 1990. Hiện nay, hằng năm người ta sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme. Chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất.

Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ ràng làm tăng tỷ lệ tiêu hoá cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao nên nghiên cứu cần sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề cần thiết.

CHƢƠNG 2

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Vi sinh vật

Các chủng xạ khuẩn phân lập được trong đất trồng khu vực Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc.

2.1.2. Hóa chất – Thiết bị

Hóa chất

Giấy lọc; Cacboxyl methyl cellulose (CMC); Thuốc thử Lugol 1%, đỏ Côngô 1%; Các hóa chất: NaNO3, MgSO4.7H2O, KCl, saccarose... các hóa chất thông dụng khác.

Thiết bị

Tủ ấm ,tủ sấy Binder; Nồi hấp (TOMY- Nhật); Máy lắc; Máy li tâm ( Shorwall super T21 – Mỹ ); Cân điện tử ( Presica XT 320M – Thụy Sĩ ); Kính hiển vi quang học; Các dụng cụ khác trong Phòng thí nghiệm Vi sinh vật thuộc khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.

2.2. Môi trƣờng

2.2.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn

Môi trường Czapeck- tinh bột (g/l):

Tinh bột tan: 20 KH2PO4: 1 Thạch Agar: 20

KCl: 0,5 FeSO4: 0,01 pH: 7,2

NaNO3: 3 CaCO3: 3 Nước cất: 1000ml

Môi trường Czapeck – glucose (g/l):

Glucose: 20 MgSO4.7H2O: 0,5 FeSO4: 0,01 (vết)

KCl: 0,5 CaCO3: 3 Thạch Agar: 20

NaNO3: 3 KH2PO4: 1 pH: 7,0 Nước cất: 1000ml

2.2.2. Môi trường bảo quản và giữ giống ( pH: 7,2)

Môi trường Gause I (g/l)

Tinh bột tan: 20 MgSO4.7H2O: 0,5 ThạchAgar:20

KH2PO4: 0,5 NaCl: 0,5 pH: 7,0

KNO3: 1 FeSO4:0,01(vết) Nướccất:1000ml

Môi trường Gause II (g/l)

Cao thịt: 3 Thạch Agar: 20

Pepton: 5 Nước cất: 1000ml

Glucose: 10

2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme

Thử hoạt tính: Thay nguồn cacbon bằng giấy lọc, CMC, các phế phụ phẩm nông nghiệp. Môi trường 1(g/l) NaNO3: 1,5 KCl: 0,5 Thạch Agar: 20 KH2PO4: 0,5 NaCl: 1% Nước cất: 1000ml MgSO4.7H2O: 0,5 CMC: 1% Môi trường 2(g/l) NaNO3: 1,5 KCl: 0,5 Thạch Agar: 20 KH2PO4: 0,5 NaCl: 1% Nước cất: 1000ml MgSO4.7H2O: 0,5 Bột giấy: 1%

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu

Mẫu đất được lấy ngẫu nhiên tại các vị trí khác nhau theo các độ sâu : 5cm, 10 cm,15cm, 20 cm, 25cm, 30cm.

Ở mỗi độ sâu lấy từ 10- 15g đất cho vào túi nilon vô trùng. Mỗi túi nilon đựng một mẫu đất ở một độ sâu nhất định. Miệng túi buộc kín để tránh bay hơi nước và các VSV lạ. Trên mỗi túi ghi đầy đủ các thông tin: Nơi lấy

mẫu, loại đất, thời gian và độ sâu lấy mẫu. Sau đó các mẫu đất được bảo quản và chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập. Những mẫu chưa phân lập được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-5ºC.

2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất

Dùng dụng cụ vô trùng lấy 1g đất cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nước cất rồi dùng pipet hút 1ml dung dịch đất này cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất vô trùng lắc đều thu được dịch đất có độ pha loãng 10-1. Cứ tiếp tục như vậy với ống nghiệm tiếp theo ta có các dung dịch đất ở các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4,…10-10. Tùy theo mật độ phân bố của xạ khuẩn trong mẫu đất mà ta chọn dịch đất có độ pha loãng thích hợp.

Ở đây tôi chọn độ pha loãng 10-5

, 10-6. Dùng pipet vô trùng hút 0,5ml dung dịch đất có độ pha loãng 10-5

, 10-6 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri, lấy bàn trang thủy tinh trang đều khắp mặt thạch.Với mỗi mẫu đất ở các độ sâu khác nhau cấy lên 3 môi trường: Gause I, Czapeck- tinh bột, Czapeck- glucose.

Sau đó nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30ºC, theo dõi các khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên bề mặt thạch. Cấy chuyền những khuẩn lạc xạ khuẩn mọc riêng rẽ không bị nhiễm sang ống thạch nghiêng có chứa môi trường Gause I. Các giống này được đưa vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 30ºC sau 3 - 4 ngày mang ra kiểm tra lại nếu thấy ống nghiệm nào không mọc hoặc bị nhiễm thì loại bỏ. Tiến hành cấy chuyền lại để được các chủng thuần.

2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống

Cấy truyền định kì 2 tháng 1 lần trên môi trường Gause I, để mẫu cấy nuôi trong tủ ấm 28- 300C từ 7- 10 ngày, sau đó giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2- 4ºC. Trước khi sử dụng phải cấy chuyền trong ống thạch nghiêng mới.