4. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài
2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme
Thử hoạt tính: Thay nguồn cacbon bằng giấy lọc, CMC, các phế phụ phẩm nông nghiệp. Môi trường 1(g/l) NaNO3: 1,5 KCl: 0,5 Thạch Agar: 20 KH2PO4: 0,5 NaCl: 1% Nước cất: 1000ml MgSO4.7H2O: 0,5 CMC: 1% Môi trường 2(g/l) NaNO3: 1,5 KCl: 0,5 Thạch Agar: 20 KH2PO4: 0,5 NaCl: 1% Nước cất: 1000ml MgSO4.7H2O: 0,5 Bột giấy: 1%
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu đất được lấy ngẫu nhiên tại các vị trí khác nhau theo các độ sâu : 5cm, 10 cm,15cm, 20 cm, 25cm, 30cm.
Ở mỗi độ sâu lấy từ 10- 15g đất cho vào túi nilon vô trùng. Mỗi túi nilon đựng một mẫu đất ở một độ sâu nhất định. Miệng túi buộc kín để tránh bay hơi nước và các VSV lạ. Trên mỗi túi ghi đầy đủ các thông tin: Nơi lấy
28
mẫu, loại đất, thời gian và độ sâu lấy mẫu. Sau đó các mẫu đất được bảo quản và chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập. Những mẫu chưa phân lập được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-5ºC.
2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất
Dùng dụng cụ vô trùng lấy 1g đất cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nước cất rồi dùng pipet hút 1ml dung dịch đất này cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất vô trùng lắc đều thu được dịch đất có độ pha loãng 10-1. Cứ tiếp tục như vậy với ống nghiệm tiếp theo ta có các dung dịch đất ở các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4,…10-10. Tùy theo mật độ phân bố của xạ khuẩn trong mẫu đất mà ta chọn dịch đất có độ pha loãng thích hợp.
Ở đây tôi chọn độ pha loãng 10-5
, 10-6. Dùng pipet vô trùng hút 0,5ml dung dịch đất có độ pha loãng 10-5
, 10-6 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri, lấy bàn trang thủy tinh trang đều khắp mặt thạch.Với mỗi mẫu đất ở các độ sâu khác nhau cấy lên 3 môi trường: Gause I, Czapeck- tinh bột, Czapeck- glucose.
Sau đó nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30ºC, theo dõi các khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên bề mặt thạch. Cấy chuyền những khuẩn lạc xạ khuẩn mọc riêng rẽ không bị nhiễm sang ống thạch nghiêng có chứa môi trường Gause I. Các giống này được đưa vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 30ºC sau 3 - 4 ngày mang ra kiểm tra lại nếu thấy ống nghiệm nào không mọc hoặc bị nhiễm thì loại bỏ. Tiến hành cấy chuyền lại để được các chủng thuần.
2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
Cấy truyền định kì 2 tháng 1 lần trên môi trường Gause I, để mẫu cấy nuôi trong tủ ấm 28- 300C từ 7- 10 ngày, sau đó giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2- 4ºC. Trước khi sử dụng phải cấy chuyền trong ống thạch nghiêng mới.
29
2.3.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
2.3.4.1. Phương pháp quan sát hình thái và tính chất nuôi cấy xạ khuẩn Quan sát màu sắc của HSKS
Dựa theo tài liệu của Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc của HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh...
Quan sát màu sắc của HSCC
Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961)
Quan sát cuống sinh bào tử
Phương pháp 1: Phương pháp xẻ rãnh khối thạch:
Xạ khuẩn được rải đều trên bề mặt hộp petri chứa môi trường Gause I. Dùng dao vô trùng xẻ hai đường song song ở giữa hộp lồng, bỏ khối thạch ở giữa 2 đường xẻ ra ngoài. Sau đó đặt lamen vô trùng chéo theo rãnh thạch vừa xẻ. Để hộp lồng nuôi cấy trong tủ ấm 3- 5 ngày, lấy lamen ra quan sát phần xạ khuẩn mọc lan ra hai đường xẻ trên kính hiển vi quang học.
Phương pháp 2: Găm lamen nghiêng 450
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I có găm lamen nghiêng 450 trên bề mặt môi trường. Sau 7- 9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy ra qaun sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lượn sóng kí hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn kí hiệu là RA (Rectinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales).
30
Sự hình thành sắc tố tan
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường: Gause- I, Gause- II, Czapeck- glucose, Czapeck- tinh bột ở nhiệt độ phòng. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát sắc tố tan tiết ra môi trường.
2.3.4.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa Khả năng chịu muối
Tiến hành cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng Gause- I có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ 0,5; 2; 4; 6; 10; 14 (%). Sau 7- 10 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng.
Khả năng sử dụng các nguồn cacbon
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Czapeck- glucose trong đó thay đổi các nguồn đường: Glucose, sacarose, mantose, fructose…
Cách làm : Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch đĩa Petri chứa môi
trường có các nguồn đường trên ở nhiệt độ 28- 300
C, sau 14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đối chứng.
Trong đó môi trường có glucose được coi là đối chứng (+) và môi trường không có đường được coi là đối chứng âm (-).
+ Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dương một ít: có khả năng sử dụng loại đường đó. Kí hiệu là (+).
+ Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương. Kí hiệu là (++). + Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc :không có khả năng sử dụng loại đường đó. Kí hiệu là (-).
+ Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém hơn đối chứng dương nhiều. Kí hiệu là (+-) .
31
Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Chiết dịch enzyme
Thu enzyme từ môi trường lỏng: xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi trường Gause- II dịch thể sẽ được lọc bỏ sinh khối hoặc li tâm 4000 vòng /phút trong 15 phút, chiết dịch trong thì thu được enzyme thô.
Xác định hoạt tính các enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau:
- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylase) - CMC (xác định hoạt tính cellulase)
- Bột sữa (xác định hoat tính protease)
Chuẩn bị môi trường cơ chất – thạch gồm: 20g thạch + 2- 10 g cơ chất, pha môi trường trong 1000 ml nước. Thanh trùng ở 1atm trong 30 phút. Đổ môi trường vào các đĩa petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d= 10 mm) ở giữa hộp Petri. Nhỏ 0,2 ml dung dịch enzyme cần thử , để ở tủ lạnh 40C khoảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 300C trong 24 giờ .
Hoạt tính enzyme được xác định bằng giá trị D –d(mm). Sau khi nhuộm màu đỏ Cônggô (cơ chất CMC), axit tricloaxetic (cơ chất bột sữa) và thuốc thử Lugol (cơ chất tinh bột). Vùng cơ chất bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch.
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn
Phương pháp nhỏ dịch
Nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường Gause I, 160 vòng/ phút trong 3 ngày. Sau đó li tâm 4000 vòng/phút loại sinh khối. Nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào lỗ thạch trong đĩa petri trong môi trường chứa cơ chất và thạch. Để hộp lồng vào trong tủ lạnh 4h, sau đó nuôi trong tủ ấm 2 ngày. Thử hoạt tính bằng
32
thuốc thử rồi đo vòng phân giải. Xác định hoạt tính cellulase bằng môi trường chứa 1% CMC và bột giấy, thử bằng thuốc thử Lugol I.
Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bị môi trường thạch đĩa chứa 1% CMC hoặc bột giấy. Dùng que cấy chấm nhẹ vào khuẩn lạc sau đó chấm nhẹ một điểm xuống bề mặt thạch đĩa. Nuôi khuẩn lạc trong tủ ấm sau 4 ngày mang ra thử hoạt tính với thuốc thử Lugol I, đo kích thước vòng phân giải.
33
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập xạ khuẩn từ đất trồng
Tiến hành phân lập các mẫu đất ở các độ sâu khác nhau theo thứ tự 0cm, 5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm trên 3 môi trường: Gause I, Czapeck- glucose, Czapeck- Tinh bột. Kết quả trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng STT Độ sâu Độ pha loãng Môi trƣờng Gause I Czapeck- glucose Czapeck- Tinh bột 1 0 cm 10-5 10-6 T1 2 5 cm 10-5 T2 T15 10-6 3 10 cm 10-5 T3 10-6 T4,T5 4 15 cm 10-5 T6, T7, T8 10-6 T9, T10, T11 T16 5 20 cm 10-5 T12 10-6 T17 T18 6 25 cm 10-5 T13 10-6 7 30 cm 10-5 T14 T19 10-6
Trên 3 môi trường Gause I, Czapeck - glucose, Czapeck- tinh bột cả xạ khuẩn, nấm mốc và một số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân giải cellulose. Nhưng có thể phân biệt các khuẩn lạc này: Khuẩn lạc vi khuẩn thường nhày, ướt và nhẵn. Khuẩn lạc nấm mốc cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc xạ khuẩn nhưng khác ở chỗ nó phát triển nhanh và to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần. Khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông, xốp, khô, rắn chắc, xù xì, nếu không có HSKS thì khuẩn lạc có dạng
34
màng dẻo. Sau 3 ngày phát triển khuẩn lạc xạ khuẩn có kích thước khoảng 0,5- 2mm. Qua kết quả phân lập xạ khuẩn từ đất trồng tại Xuân Hòa- Phúc Yên- Vĩnh Phúc thu được kết quả sau:
Ở độ sâu 5cm, 10cm, 15cm và môi trường Gause I phân lập được nhiều xạ khuẩn nhất. Xạ khuẩn là loại VSV hoại sinh, hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 25- 30oC, độ ẩm thích hợp từ 40-50%, pH trung tính hoặc kiềm nhẹ. Ở độ sâu 5cm, 10cm, 15cm có những điều kiện tối ưu như: cường độ ánh sáng vừa phải, nhiệt độ tương đối ổn định, xác hữu cơ được tích tụ và phân giải dưới tác động của nhiều nhóm VSV tạo thành các chất hữu cơ trung gian và hàm lượng oxi hòa tan khá cao, ngoài ra các điều kiện về độ ẩm, độ pH... đều thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển của xạ khuẩn nên ta phân lập được nhiều xạ khuẩn ở ba độ sâu này.
Môi trường Gause I có thành phần môi trường thích hợp nhất với sự phát triển của xạ khuẩn nên khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên môi trường này nhiều hơn trên 2 môi trường Czapeck - glucose và Czapeck- tinh bột, vì thế ta phân lập được nhiều xạ khuẩn từ môi trường này.
35
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
Tiến hành nghiên cứu đặc điểm HSKS, HSCC... của các chủng xạ khuẩn đã phân lập được. Nuôi cấy các chủng này trên môi trường Gause I, sau 3-5 ngày đem quan sát. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
STT Chủng xạ khuẩn Màu sắc khuẩn lạc HSKS HSCC 1 T1 Trắng Nâu nhạt 2 T2 Xám Xám Xanh 3 T3 Nâu Vàng 4 T4 Hồng Vàng Ôliu 5 T5 Hồng Đỏ gạch 6 T6 Trắng Vàng ôliu 7 T7 Xám Vàng 8 T8 Hồng Xám 9 T9 Trắng Không có
10 T10 Xanh da trời Xanh đậm
11 T11 Trắng Vàng 12 T12 Nâu Vàng xám 13 T13 Xanh Xanh nhạt 14 T14 Trắng Xám Xanh 15 T15 Hồng Xanh 16 T16 Nâu Nâu 17 T17 Hồng Vàng xỉn 18 T18 Xám Vàng xỉn
Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập chủ yếu có dạng xù xì hoặc dạng bẹt, có kích thước khá nhỏ so với khuẩn lạc của các loài VSV khác, khoảng 0,5 – 2mm. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hướng sinh trưởng trong môi trường tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trường tạo ra HSKS. Màu sắc của HSKS và HSCC rất đa dạng và phong phú: vàng, nâu, xám, hồng, xanh... Và đây là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn, nhờ vào đó ta có thể xác định xạ khuẩn được phân lập thuộc chi nào, họ nào, ngành nào...
36
Căn cứ vào kết quả thu được chúng tôi đưa ra một số nhận xét sau:
Đất là môi trường tốt nhất cho xạ khuẩn phát triển; Cùng một loại đất ở các độ sâu khác nhau sự phân bố của xạ khuẩn là khác nhau; Chúng tôi đã phân lập được 18 chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase khá mạnh. Trong đó 4 chủng có hoạt tính cellulase mạnh nhất là T5, T7, T9, T13. Từ đó chúng tôi đã lựa chọn 4 chủng này để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
a b c
d e f
Hình 3.2.Một số hình ảnh xạ khuẩn
a, b. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn phân lập được
c, d, e, f. Hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn nghiên cứu
3.3. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. nghiên cứu.
Tôi tiến hành nuôi cấy bốn chủng T5, T7, T9, T13 trên môi trường Gause- I để quan sát khả năng sinh trưởng của chúng và màu sắc của hệ khuẩn ty. Kết quả cho thấy tùy từng chủng xạ khuẩn khác nhau mà màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh và sắc tố hòa tan là khác nhau:
37
Chủng T5: HSKS màu hồng, HSCC màu đỏ gạch ,sắc tố tan màu hồng nhạt, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24- 48h, cuống sinh bào tử có dạng xoắn.
Chủng T7: HSKS màu xám, HSCC màu vàng, sắc tố tan vàng nhạt, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24- 48h, cuống sinh bào tử dạng xoắn thẳng.
Chủng T9: HSKS màu trắng, không có HSCC, sắc tố tan màu trắng đục, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24- 48h, cuống sinh bào tử thẳng có móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
Chủng T13: HSKS màu xanh, HSCC màu xanh nhạt, sắc tố tan màu xanh nhạt, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24- 48h, cuống sinh bào tử có dạng thẳng lượn sóng.
a b c
d e f
Hình 3.3. Hình ảnh hệ sợi và cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
a,b. Hệ sợi của xạ khuẩn
c, d, e, f. Cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn T5, T7, T9, T13 tương ứng được nghiên cứu
38
Bào tử của xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh – gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn. Hình thái cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [9]. Tuy nhiên, số lượng bào tử và hình dạng của chuỗi là khác nhau ở các đơn vị phân loại khác nhau.
Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein
với độ dày khoảng 300 – 400 A0
chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi từ ngoại cảnh như nhiệt độ, pH… Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn [13].
3.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
3.4.1. Khả năng chịu muối
Bốn chủng T5, T7, T9, T13 được nuôi cấy trong môi trường Gause –I có bổ sung NaCl ở các nồng độ 0,5; 2; 4; 6; 10; 14 và 0% đối chứng. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.3. Khả năng chịu muối của 4 chủng T5, T7, T9, T13
NaCl (%) Chủng 0,5 2 4 6 10 14 0 T5 +++ +++ ++ ++ + + - T7 +++ ++ + + + - - T9 +++ + ++ + + - - T13 +++ ++ ++ + + - -
Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường +: Sinh trưởng yếu; - : Không sinh trưởng
39
Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn.