Cột (đường kính (p = 2 cm, dài 50 cm) được lắp cố định vào giá, đáy cột có lót một lớp bông. Chất hấp phụ là Silicagen cỡ hạt 60 - 200 |j.m (đã được hoạt hoá ở 110°c/ giờ) được trộn đều vói cloroíorm thành một hỗn dịch. Mỏ' khoá ở cột, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy để chất hấp phụ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Tiếp tục dùng dung môi hứng được rót lên cột và cho chảy liên tục một thời gian đến khi cột chất hấp phụ hoàn toàn ổn định (Chú ý trong suốt quá trình thực hiện không được để dung môi khô ở cột).Tỷ lệ Silicagen và chất cần tách là khảng [50:1].
* Chuẩn bị hỗn hợp chất cần tách: Hoà tan cắ n A trong một lượng tối thiểu Methanol, rồi trộn với một lượng Silicagen thành bột tơi khô (Bột A- S).
*Đưa chất lên cột: Cột sau khi đã được ổn định, đưa phần bột (A- S) đã chuẩn bị ở trên vào cột, dàn đều thành một lớp mỏng. Phủ lên bề mặt một lớp mỏng Silicagen.
* Khai triển cột và rửa giải cột: Dùng hệ dung môi Cloroíòrm: Methanol với tỷ lệ thay đổi dần từ [100: 0], [98: 2] đến [82: 18]. Ta hứng được 117 ống. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi: Toluen: Ethylacetat: Acid formic [5: 6 : 1,5], theo dõi từ đó gộp được các ống có số vết với Rf tương tự nhau, được 6 phân đoạn.
+ Các phân đoạn 1, 2, 4, 5, 6 có nhiểu vết.
+ Phân đoạn 3 (từ ống 54 đến 72) có 3 vết trong đó có một vết rất đậm. Do đó ta lấy phân đoạn này để phân lập tiếp.
* Phân đoạn 3 lại tiếp tục chạy sắc ký cột lần 2 với cách tiến hành như lần 1. Qua kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng gộp được 3 phân đoạn
+ Phân đoạn 1,: ố n g 1 - 17 có 2 vết.
+ Phân đoạn 2,: ố n g 18 - 24 có một vết (vết đậm cần tách). + Phân đoạn 3,: ố n g 25 - 50 có 2 vết.
Lấy phân đoạn 2|, để dung môi bay hơi tự nhiên thấy kết tinh được chất tinh thế hình kim màu vàng nhạt. Đặt tên chất này là LC1.
* Nhận dạng chất LC1:
- Tính chất: Tinh thể hình kim màu vàng nhạt tan trong methanol, ethanol và ethylacetat. (ảnh 6)
* Kiểm tra độ tinh khiết của chất LC2 bằng sắc ký lớp mỏng - Các hệ dung môi khai triển:
+ Hệ 1: Toluen: Ethylacetat: Acid íormic [5: 6 : 1,5]
+ Hệ 2: Ethylacetat: Acid íormic: Cloroíorm [8 :1 :1 ] (ảnh 7) + Hệ 3: Ethylacetat: Acid íormic: Nước [19: 1:1].
Kết quả được thể hiện ở bảng 4
Bảng 4. Kết quả sắc kỷ lớp mỏng của chất LC1 Hệ Rf X 100 AST >1 = 366 nm X = 254 nm T.T FeCl3 5% Hơi Iod
1 50 Vàng nhạt Xanh sáng Vàng Xanh tím Nâu
2 72 Vàng nhạt Xanh sáng Vàng Xanh tím Nâu
3 69 Vàng nhạt Xanh sáng Vàng Xanh tím Nâu
Phổ tử ngoại của chất LC1 có hai đỉnh ở bước sóng 208 nm và 323 nm. Phổ hồng ngoại của chất LC1 có các đỉnh: 418,67 cm '1, 771,59 cm 1219,7 cm' \ 1296,16 cm‘\ 1434,42 cm 1 , 2939,97 cm' 1
*Nhân xét: Với quy trình chiết xuất và tách như trên, chúng tôi đã thu được chất LC1. Khi kiểm tra độ tinh khiết của chất LC1 bằng sắc ký lớp mỏng với 3 hệ dung môi khác nhau với các thuốc thử hiện màu khác nhau đều cho một vết. Điều này chứng tỏ chất LC1 đạt độ tinh khiết cần thiết.
Ảnh 6:
Tinh thể chất LC1
0 , 1 r o m
Ảnh 7:
Sắc ký đổ chất LC1 (a) dưới ánh sáng thường; (b) dưới đèn ƯV A = 366nm