Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

2.2.3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coliDH5α DH5α

Sau khi găn san phõm đƣơc biờn nap vao E. coli DH5α. Cỏc khuẩn lạc

E.coli chƣa vectơ tai tụ hơp mang san phõm PCR đƣơc chon loc trờn mụi trƣơng LB chƣa ampixilin , IPTG va Xgal .

Phƣơng phap biờn nap ADN plasmid vào tế bào E. coli chủng DH 5α

đƣơc tiờn hanh nhƣ sau :

- Lõy tờ bao kha biờn DH5α trong tu lanh – 750 C đờ trờn đa 30 phỳt. - Trụn 4àl dung dich phan ƣng găn (ligate) vào ống tế bào khả biến , sau

đo đờ trờn đa 30 phỳt.

- Sục nhiờt ơ 420C, thơi gian 1 phỳt 30 giõy, sau đo đờ trờn đa 2 phỳt. - Bụ sung 300 àl mụi trƣơng LB long , sau đo nuụi lăc tục đụ 200 v/p

370C trong 1 giơ.

- Cõy trai toan bụ dich tờ bao đa biờn nap trờn mụt đia mụi trƣơng LB đăc (pepton, cao nõm men, NaCL va agar) chƣa ampixilin (100àg/ml), Xgal va IPTG.

- Giƣ đia cõy vi khuõn trong tu õm 370C qua đờm.

2.2.3.6. Phương phỏp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc

Kết quả của quỏ trỡnh biến nạp là tổ hợp của cỏc khuẩn lạc xanh và trắng. Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony - PCR với cặp mụ̀i pUC18-F1/pUC18-R1.

Thành phần phản ứng colony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ khỏc cặp mụ̀i sử dụng và mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc, nhiệt độ gắn mụ̀i

530C. Điện di sản phẩm colony-PCR trờn gel agarose 1% để chọn ra cỏc khuẩn lạc chứa plasmid nhƣ mong muốn. Đụ̀ng thời, nuụi những khuẩn lạc

2.2.3.7. Tỏch chiờt plasmid

- Lõy 1,5 ml dich n uụi cõy vao ụng eppendorf . Ly tõm 5000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt để thu cặn tế bào.

- Bụ sung 150 àl dung dich I , trụn đờu băng may voltex . - Bụ sung 150àl dung dich II , đao nhe băng tay khoang 3 lõn.

- Tiờp tuc bụ sung 150àl dung dich III , đao nhe băng tay khoang 3 lõn. - Thờm 400àl chlorofom : isoamyl alcohol (24:1) đao nhe.

- Ly tõm 13.000 vũng/ phỳt trong 15 phỳt.

- Dựng pipet hỳt 400àl Natri axetat 3M, pH 5.2 và 1ml cụn 100%. Đờ ADN- plasmit tua – 200C it nhõt 2 giơ.

- Ly tõm13.000 vũng/ phỳt trong10 phỳt, loại bỏ dịch nổi thu cặn AD- Nplasmid.

- Rƣa căn ADN- plasmit 1 lõn băng 600àl cụn 70%. - Ly tõm 13.000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt, thu căn - Làm khụ cặn ADN – plasmid trong box cõy .

- Hũa cặn ADN- plasmit trong 40 àl TE co ARNase (nụng đụ 100àl/ml). - Ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1 giơ đờ loai ARN .

- Kiểm tra Sản tỏch plasmid trờn gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đú gel đƣợc nhuộm trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ỏnh sỏng đốn cực tớm.

2.2.3.8. Phương phỏp xỏc định trỡnh tự gen bằng thiết bị tự động

Xỏc định trỡnh tƣ ADN theo phƣơng phap thụng dung nhõt đo la xac đinh trƣc tiờp thụng qua phan ƣng kờt thuc đõu cuụi - phƣơng phap enzym e của Sanger (1977). Vơi cac đoan mụi co găn huynh quang va bụ hoa chõt chuõn(kit) để nhõn trỡnh tự gen băng PCR vơi Taq ADN polymerase. Chu trinh nhiờt: 950C

36 giõy, 500C 36 giõy, 720C 84 giõy, kờt thuc ơ 40C. Sau đo san phõm nhõn gen cú gắn huỳnh quang đƣợc biến tớnh bằng nhiệt và phõn tớch trờn mỏy xỏc định trỡnh tự ADN tự độ ng ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer. Sụ liờu nhõn đƣơc xƣ ly trờn may vi tinh băng phõn mờm Clustalx.

Chƣơng 3

KấT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA HẠT VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC

GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIấN CỨU

3.1.1. Đặc điểm hình thỏi, kớch thƣớc và khối lƣợng hạt 5 giống đậu tƣơng nghiờn cứu

Hỡnh thỏi và khối lƣợng hạt là một trong những đặc tớnh quan trọng đƣợc quan tõm trong cụng tỏc chọn tạo giống đậu tƣơng. Kết quả phõn tớch đặc điểm hỡnh thỏi của 5 giống đậu tƣơng địa phƣơng theo cỏc tớnh trạng màu sắc hạt, màu sắc rốn hạt, sụ lƣơng, khối lƣợng hạt đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.1và bảng 3.1.

Bảng 3.1. Màu sắc, sụ lƣơng và khối lƣợnghạt của 5 giống đậu tƣơng nghiờn cứu

Giống Màu vỏ hạt Màu rốn

hạt Khối lƣợng 1000 hạt (g) Thỏi Nguyờn Vàng Đen 68 DT84 Vàng Nõu 145

BD Vàng phơt xanh Nõu 70

BH Vàng Đen 106

Cỳc

Tuyờn Vàng Đen 68

Bảng 3.1 cho thấy hầu hết màu vo hat của cỏc giống đậu tƣơng chủ yếu cú màu vàng và vàng pha. Màu sắc rốn hạt cú màu nõu và đen, đõy là một đặc tớnh quan trọng trong việc giỏm định giống.

Cỏc giống đậu tƣơng khỏc nhau cú khối lƣợng khỏc nhau, khối lƣợng 1000 hạt phụ thuộc vào kớch thƣớc và độ đụ̀ng đều của hạt. Thƣơ ng kớch thƣớc hạt lớn thỡ khối lƣợng 1000 hạt sẽ cao. Khối lƣợng hạt của 5 giống đậu tƣơng nghiờn cƣu dao động từ 68g đến 106g. Trong cỏc giống địa phƣơng thỡ giống BH cú khối lƣợng 1000 hạt cao nhất 106g vƣợt hẳn so với cỏc giống đậu tƣơng cũn lại, thấp nhất là giống TN va CT cú khối lƣợng 68g. Cú thể xếp theo thứ tự từ cao đến thấp về khối lƣợng 1000 hạt của cỏc giống đậu tƣơng nhƣ sau: DT84 >BH >BD>TN,CT.

3.1.2. Khả năng chịu hạn của 5 giống đậu tƣơng

Đờ đanh gia kha năng chiu han cua cac giụng đõu tƣơng gop phõn đinh hƣơng cho viờc chon cac giụng chiu han co hiờu qua , chỳng tụi tiến hành trụng thi nghiờm va gõy han nhõn tao khi cõy non xuõt hiờn 3 lỏ thật nhằm nghiờn cƣu đanh gia nhanh kha năng chiu han của cỏc giống đậu

qua theo doi cac chi tiờu : Tỉ lệ cõy khụng hộo , tỉ lệ cõy phục hụ̀i sau 3, 5 và 7 ngày và xỏc định chỉ số chịu hạn tƣơng đối , kết quả trỡnh bày trờn bảng 3.2.

A

Sau 5 ngày Sau 7 ngày Sau 9 ngày

B

Hỡnh 3.2. Hỡnh ảnh cõy đậu tƣơng non 3 lỏ

Bảng 3.2. Khả năng chiu hạn của cỏc giụng đậu tƣơng nghiờn cứu

STT Tờn giống Chỉ số chịu hạn

tƣơng đụi (%) Sụ ngày hạn cõy chờt 100 % (ngày) 1 Thỏi Nguyờn 1682,99 13 2 DT84 215,07 11 3 Bản Dốc 3595,77 15 4 Vàng Bắc Hà 1880,13 14 5 Cỳc Tuyển 262,07 12

Khi bị hạn, lƣợng nƣớc trong tế bào giảm gõy tổn thƣơng cho cõy. Cỏc giống cõy khỏc nhau sẽ cú những đỏp ứng khỏc nhau để làm giảm hoặc trỏnh bị tổn thƣơng. Theo dừi thớ nghiệm cho thấy sau khi xử lý hạn tại thời điểm hạn 3 ngày cõy đậu tƣơng bắt đầu bị ảnh hƣởng một số cõy bị hộo lỏ, những ngày hạn tiếp theo mức độ ảnh hƣởng tăng lờn rừ rệt. Từ kết quả đỏnh giỏ khả năng chịu hạn thụng qua cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu tỉ lệ cõy khụng hộo sau 3, 5, 7 ngày hạn và lờ cõy phuc hụi sau 3, 5, 7 ngày hạn , chỳng tụi đó tớnh toỏn đƣợc chỉ số chịu hạn tƣơng đối của cỏc giống đậu tƣơng ở giai đoạn cõy non 3 lỏ. Giống BD cú chỉ số chịu hạn cao nhất (Sn = 3595,77 ) sau đú là giống Vàng Bắc Hà (Sn = 1880,13), thấp nhất là giống DT84 (Sn = 215,07). Những giống cú chỉ số chịu hạn tƣơng đối lớn thỡ cú khả năng chịu hạn càng cao và ngƣợc lại. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cõy non 3 lỏ của 5 giống đậu tƣơng cú thể xếp theo thứ tự: BD > BH> TN> CT> DT84. Nhƣ vậy, ở giai đoạn cõy non giống BD cú khả năng chịu hạn tốt nhất. giống DT84 cú khả năng chịu hạn thõp nhất . Tỷ lệ cõy chết 100% sau thơi gian xƣ ly han giụng DT84 11 ngày, Cỳc tuyển 12 ngày, Thỏi nguyờn 13 ngày, Vàng Bắc Hà và Bản Dốc là 14 và 15 ngày tƣơng ứng .

3.2. KấT QUA PHÂN LẬP VA XAC ĐINH TRèNH TƯ GEN CYSTATIN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG

3.2.1. Kết quả tỏch chiết ARN tụng sụ

Hạt đậu tƣơng tỏch từ quả non của giống Thỏi Nguyờn đƣơc sƣ dung đờ tỏch chiết ARN tổng số . Quả đƣơc giữ ở - 85°C cho đến khi sử dụng. Hạt tỏch tƣ qua non đƣơc nghiờn than h bụt min trong cụi chay sƣ . Chỳng tụi sử dụng bộ Kit Trizol Reagents (của hóng Invitrogen) để tỏch chiết RNA tổng số. Sau khi phõn tach , kiểm tra san phẩm ARN tỏch chiết đƣợc bằng phƣơng phỏp điện di trờn gel agarose 0,8%, kết quả thờ hiờn ơ hinh 3.3.

Hỡnh 3.3. Kết quả tỏch chiết RNA tổng số

Kết quả (hỡnh 3.3) cho thấy ARN tổng số thu đƣợc cú hàm lƣợng cao, chất lƣợng tốt, đảm bảo cho việc tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo. Tuy nhiờn, chỳng tụi khụng sử dụng hệ đệm đặc trƣng cho phõn tỏch ARN nờn khụng thể phõn tỏch cỏc băng của ARN tốt.

Do ARN là loại phõn tử khụng bền, dễ bị thủy phõn bởi cỏc ribonuclease (RNase). Hơn nữa cỏc RNase lại cú mặt khắp nơi, hoạt tớnh mạnh và rất bền. Vỡ thế, việc tỏch chiết ARN đũi hỏi phải thao tỏc thật cẩn thận để trỏnh mọi tạp nhiễm chứa RNase từ mụi trƣờng, tất cả cỏc dụng cụ phải đƣợc xử lý trƣớc khi tiến hành thớ nghiệm: cối chày sứ đƣợc xử lý ở 1210C trong 3 giờ,

cỏc dụng cụ nhƣ ống eppendorf, đầu tớp,… đƣợc xử lý trong DEPC 0,1%, cỏc húa chất khỏc (cụ̀n 700, H2O) đƣợc pha trong nƣớc 0,1% DEPC.

Trong quỏ trỡnh tỏch chiết, việc nghiền mẫu trong nitơ lỏng để phỏ vỡ thành tế bào và giải phúng cỏc thành phần trong tế bào đũi hỏi phải thao tỏc nhanh. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn phải bổ sung ngay Trizol rengents. Nếu khụng, nuclease nội bào đƣợc giải phúng sẽ thủy phõn ARN. Cỏc thành phần trong Trizol reagents nhƣ phenol, guanidine isothiocyanate sẽ nhanh chúng biến tớnh protein, polysaccarit cú trong hỗn hợp. Việc bổ sung thờm Chloroform: Isoamine (24 : 1) cú tỏc dụng kết tủa những chất trờn và tỏch pha tốt trong quỏ trỡnh ly tõm. Sản phẩm ARN tổng số đƣợc hũa tan trong nƣớc 0,1% DEPC cú tỏc dụng ngăn cản quỏ trỡnh RNase thủy phõn RNA.

3.2.2. Kết quả khuếch đai gen Cystatin

Từ ARN tổng số, chỳng tụi tiến hành phản ứng RT-PCR với cặp mụ̀i đặc hiệu (Cys-SoyF va Cys SoyR). để nhõn gen cystatin . Theo ti nh toỏn lý thuyết sẽ nhõn đƣơc băng DNA cú kớch thƣớc khoảng 738 bp.

Để kiểm tra kết quả sản phẩm RT -PCR, chỳng tụi tiến hành điện di trờn gel agarose 1%, Kết quả đƣơc thể hiện ở hỡnh 3.4.

bp

1000 750 500

Kết quả RT-PCR trờn hỡnh 3.4 cho thấy, đó nhõn đƣợc mụt băng ADN cú kớch thƣớc khoảng xấp xỉ 750 bb. Kết quả này hoàn toàn phự hợp với sụ liờu tinh toỏn lý thuyết thiết kế cặp mụ̀i.

Cú rất nhiều yếu tố cú thể ảnh hƣởng tới chất lƣợng của phản ứng RT- PCR nhƣ: lƣợng ARN quỏ ớt hoặc quỏ nhiều, nụ̀ng độ mụ̀i quỏ cao hoặc quỏ thấp, nhiệt độ gắn mụ̀i chƣa phự hợp,.... Vỡ vậy, trong quỏ trỡnh tiến hành phản ứng, cần điều chỉnh hàm lƣợng cỏc thành phần phản ứng (lƣợng mẫu, nụ̀ng độ mụ̀i, nhiệt độ gắn mụ̀i, Mg2+, thời gian đối với mỗi bƣớc của chu kỳ nhiệt,…) để phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Để loại cỏc tạp chất nhƣ muối, cỏc nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mụ̀i, enzyme, đệm,… Vỡ thế để phản ứng ghộp nối đạt đƣợc hiệu quả cao nhất cần thiết phải cú quỏ trỡnh tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ cỏc thành phần khụng mong muốn. Qui trỡnh tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ Kit QIAquick Gel Extraction.

3.2.3. Kết quả biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Sản phẩm ghộp nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α bằng phƣơng phỏp sốc nhiệt, sau đú đƣợc nuụi phục hụ̀i và đƣợc cấy trải trờn mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung khỏng sinh, cơ chất và chất cảm ứng với nụ̀ng độ thớch hợp. Hiệu suất của quỏ trỡnh biến nạp phụ thuộc chủ yếu vào 2 yếu tố:

Thứ nhõt: tế bào khả biến phải đảm bảo tốt.

Hỡnh 3.5. Kết quả biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli

DH5α

Kết quả hỡnh 3.5, cho thấy đó thu đƣợc một số lƣợng lớn dũng cỏc khuẩn lạc xanh trắng trờn mụi trƣờng LB đăc. Cỏc dũng khuẩn lạc này đều mang vector cú chứa gen khỏng khỏng sinh, vỡ vậy cú thể mọc trờn mụi trƣờng LB đăc chọn lọc. Trong cỏc dũng khuẩn lạc đú, khuẩn lạc xanh xuất hiện là do khụng cú đoạn gen ngoại lai chốn vào vector ma vector tự đúng vũng, hỡnh thành cấu trỳc gen lacZ hoàn chỉnh, hoạt động bỡnh thƣờng. Gen lacZ mó húa enzyme β–galactosidase của vi khuẩn E. coli. Trờn mụi trƣờng LB cú chất cảm ứng IPTG, enzyme β–galactosidase đƣợc tổng hợp, enzyme này sẽ chuyển húa cơ chất X-gal khụng mau thành chõt co màu xanh lam nờn khuẩn lạc cú màu xanh lam. Nếu nhƣ đoạn cài ADN đƣợc chốn vào giƣa gen lacZ tạo vector tỏi tổ hợp, làm gen lacZ mất hoạt tớnh, vựng promoter của gen lacZ khụng thể điều khiển gen cấu trỳc phiờn mó, đụ̀ng thời khụng thể dịch mó tạo enzyme β – galactosidase chuyển húa cơ chất X-gal nờn khuẩn lạc cú màu trắng.

Tuy nhiờn, khụng phải tất cả cỏc khuẩn lạc trắng thu đƣợc ở thớ nghiệm đều mang vector tỏi tổ hợp cú chứa đoạn gen quy định trỡnh tự gen cystatin,

mà cú thể chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, hoặc sự đột biến trờn promoter lacZ, sự đứt góy bazơ thymin đầu 3’ của vector cũng cú thể làm cho khuẩn lạc co màu trắng. Do đo, cần thực hiện quỏ trỡnh chọn dũng tế bào mang vector tỏi tổ hợp chƣa đoan ADN đung kich thƣơc .

3.2.4. Kết quả chọn dũng tế bào mang vector tỏi tổ hợp

Để chắc chắn đoan gen cystatin cú mặt trong cỏc dũng khuẩn lạc màu trắng thu đƣợc, chỳng tụi tiến hành phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc đƣợc điện di trờn gel agarose 0,8%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện trờn hỡnh 3.6 nhƣ sau:

1000 750 500

M 1 2 3 4 bp

Hỡnh 3.6. Sản phẩm PCR nhõn gen cystatin trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mụ̀i pUC18F-R (năm trờn vector ). Ghi chu: M: Thang DNA chuẩn 1Kb; Giếng

1;

2; 3; 4 lần lượt là cỏc khuẩn lạc trắng được chọn.

Theo kờt qua hỡnh 3.6, ta thấy cả bốn dũng khuẩn lạc đều cho kết quả dƣơng tớnh với phản ứng PCR. Kớch thƣớc nhõn lờn theo đỳng tớnh toỏn lý thuyết khoảng 738 bp. Qua phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc giỳp chỳng tụi cú thể chọn lọc đƣợc cỏc dũng khuẩn lạc mong muốn để thực hiện cỏc thớ

nghiệm tiếp theo. Đặc biệt đõy cũn là phƣơng phỏp thuận tiện giỳp chỳng tụi thu hẹp số lƣợng cỏc dũng khuẩn lạc cần kiểm tra.

3.2.5. Kết quả tỏch chiết plasmid tỏi tổ hợp

Cỏc dũng khuẩn lạc sau khi đƣợc chọn lọc bằng phƣơng phỏp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc, đƣợc nuụi trong mụi tƣờng LB lỏng để tỏch chiờt plasmid. Plasmid đƣợc kiểm tra trờn gel agarose 0.8%. Kết quả điện di sản phẩm plasmid

đƣợc trỡnh bày trờn hỡnh 3.7.

M 1 2 3 4

Hỡnh 3.7. Kết quả tỏch plasmid tỏi tổ hợp tƣ cac dong khuõn lac trăng

Giếng M: thang chuẩn ADN 1kb; Cỏc giếng cũn lại: Plasmid tỏi tổ hợp tỏch từ dòng khuẩn lac trăng ký hiệu 1,2, 3 và 4.

Từ kết quả điện di trờn hỡnh 3.7, cho thấy cỏc plasmid tỏi tổ hợp đều cú 3 băng rừ nột và khụng bị đứt gẫy, trong đú băng cú kớch thƣớc thấp nhất trờn bản điện di là băng rừ nột nhất, đõy là plasmid ở dạng siờu xoắn - cấu hỡnh mong đợi nhất trong quỏ trỡnh tỏch plasmid.

3.2.6. Kết quả kiểm tra cỏc dũng plasmid

Đờ khăng đinh chăc chăn la plasmid tai tụ hơp mang đung đoan ADN mong muụn chen vao . Chỳng tụi tiến hành thực hiện phản ứng cắt

plasmid bằng enzyme giơi han BamHI với hai dũng số 1 và số 2 để kiểm tra khả năng đoạn gen mà chỳng tụi thiết kế đó thực sự gắn đƣợc vào vector pBT