ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TƯ TRONG

Enzyme phiờn mó ngƣợc là một trong những enzyme cú vai trũ quyết định trong quỏ trỡnh hỡnh thành ngành sinh học phõn tử, enzyme này do cỏc retrovirus sản sinh nhằm sao chộp hờ gen RNA của chỳng trong tế bào chủ. Cỏc enzyme phiờn mó ngƣợc thƣờng đƣợc sử dụng là những enzyme cú hoạt tớnh 5' -

3' DNA polymerase sử dụng sợi mRNA làm khuụn mẫu với đoạn mụ̀i là đoạn

RNA hoặc DNA cú đầu 3'-OH tự do để sao chộp ngƣợc tạo ra sợi cDNA.

1.3.1. Kỹ thuật tổng hợp cDNA và nhõn gen

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) là sự kết hợp của hai phản ứng sao mó ngƣợc (reverse transcription) và PCR để nhõn lờn một đoạn gen quan tõm từ RNA.

(1) Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất

Nguyờn lý của phƣơng phỏp này là sử dụng enzyme sao mó ngƣợc để tổng hợp nờn sợi cDNA thứ nhất từ RNA. Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thỳc phản ứng ta sẽ thu đƣợc lƣợng cDNA tƣơng ứng với lƣợng RNA khuụn ban đầu. Để tăng hiệu quả của quỏ trỡnh tổng hợp, lƣợng mụ̀i đƣợc cho vào lớn hơn rất nhiều lƣợng RNA khuụn và chất kỡm hóm RNase cũng đƣợc đƣa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị cắt bởi RNase. Cấu trỳc mũ đầu 5' Cấu trỳc mũ đầu 5' mRNA dNTP Reverse transcriptase

AAA(A)n đuụi poly(A) đầu 3'

3'-OH 5'

Oligo(dT)12-18 primer AAA(A)n đuụi poly(A) đầu 3'

5' 3' 3'-OH 5' Oligo(dT)12-18 primer

cDNA : mRNA

AAA(A)n đuụi poly(A) đầu 3'

Hỡnh 1.3. Sơ đụ̀ phản ứng tổng hợp cDNA

(2) Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuụn để khuếch đại gen quan tõm bằng phản ứng PCR với cặp mụ̀i đặc hiệu.

Kỹ thuật PCR đƣợc Mullis và cs mụ tả đầu tiờn năm 1985. Đõy là kỹ thuật in vitro tƣơng đối đơn giản cho phộp nhõn nhanh một số lƣợng khụng hạn chế nguyờn bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xỳc tỏc của DNA polymerase. Tất cả cỏc DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuụn đều cần sự hiện diện của những mụ̀i đặc hiệu. Mụ̀i là những đoạn DNA ngắn cú khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của

mạch khuụn. DNA polymerase cú chức năng nối thờm cỏc nucleotide vào trỡnh tự mụ̀i để hỡnh thành mạch DNA mới. Quỏ trỡnh nhõn bản bằng enzyme này bao gụ̀m 3 bƣớc đƣợc lặp lại nhiều lần:

- Biến tớnh DNA từ dạng sợi kộp thành dạng sợi đơn bằng cỏch nõng cao nhiệt độ lờn 94-950C trong khoảng thời gian 30 giõy đến 1 phỳt.

- Gắn mụ̀i với đoạn DNA cần khuyếch đại thụng qua hạ nhiệt độ xuống 40-600C, trong khoảng thời gian 30 giõy đến 1 phỳt, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ (G + C)/(A + T) của đoạn mụ̀i.

- Phản ứng polymerase tổng hợp phõn tử DNA kộo dài từ đầu 3' - OH của mụ̀i. Hai phõn tử DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyờn tắc bổ sung từ hai đầu của phõn tử DNA làm khuụn. Thời gian kộo dài từ 30 giõy đến vài phỳt. Để trỏnh hiện tƣợng bắt cặp khụng đặc thự, phản ứng tổng hợp nờn đƣợc thực hiện ở

720C. Nhƣ vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lƣợng DNA cần nhõn bản sẽ tăng gấp

đụi, với N sợi khuụn ban đầu sau n chu kỳ sẽ cú Nx2n sợi DNA đƣợc nhõn lờn.

1.3.2. Kỹ thuật biến nạp plasmid vào E. coli

Plasmid là những phõn tử DNA cú kớch thƣớc nhỏ (2 – 5 Kb) dạng vũng, cú khả năng tỏi bản độc lập, khụng phụ thuộc vào sự tỏi bản của bộ gen tế bào. Trong sinh học phõn tử, plasmid đƣợc ứng dụng trong tỏch dũng gen nhằm nhõn nhanh một số lƣợng khụng hạn chế gen quan tõm của một khuẩn lạc đó đƣợc biến nạp. Plasmid sử dụng trong sinh học phõn tử phải đảm bảo cỏc yờu cầu sau: (i) kớch thƣớc nhỏ; (ii) cú gen chỉ thị cho phộp dễ dà ng phỏt hiện, nhận biết plasmid trong tế bào vi khuẩn (thƣờng là gen khỏng khỏng sinh hoặc gen tổng hợp chất màu); (iii) cú vị trớ nhận biết duy nhất của nhiều enzyme giới hạn. Một số plasmid đƣợc sử dụng nhiều trong tỏch dũng gen là

Năm 1928, Griffith mụ tả quỏ trỡnh biến nạp ở vi khuẩn trong thớ nghiệm nổi tiếng của ụng về “nguyờn lý biến nạp”. Tuy nhiờn, khụng phải tất cả cỏc vi khuẩn đều cú khả năng biến nạp. Để biến nạp cú hiệu quả, cỏc tế bào vi khuẩn cần trở nờn khả biến. Để đạt đƣợc điều này, ngƣời ta giữ cỏc tế bào vi khuẩn trong dung dịch CaCl2 lạnh trong đỏ. Khi đú cỏc tế bào trở nờn khả biến.

Việc biến nạp plasmid vào tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cỏch: - Trộn DNA plasmid với cỏc tế bào.

- Ủ ở 40C trong 20 - 30 phỳt.

- Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phỳt để plasmid cú thể xõm nhập vào tế bào. - Nuụi lắc vi khuẩn trong mụi trƣờng LB ở 370C trong vũng 60 đến 90 phỳt.

- Cỏc tế bào vi khuẩn đƣợc cấy trải trờn mụi trƣờng chọn lọc cú khỏng sinh và cơ chất tạo màu để nhõn lờn cỏc tế bào cú plasmid, mỗi tế bào sẽ phỏt triển thành một dũng riờng biệt.

Trong quỏ trỡnh biến nạp, chỉ cú một lƣợng nhỏ tế bào khả biến đƣợc biến nạp. Biến nạp là một kỹ thuật quan trọng cú thể tạo ra khoảng 10 9 cỏc tế bào biến nạp khi sử dụng 1 àg DNA plasmid.

1.3.3. Kỹ thuật tỏch dũng gen

Tỏch dũng gen là một cụng cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bƣớc khởi nguụ̀n cho cỏc kỹ thuật sau này [12]. Mục đớch của việc tỏch dũng là nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trỡnh tự gen quan tõm. Đầu tiờn, DNA ngoại lai đƣợc nối vào một vector nhằm tạo ra DNA tỏi tổ hợp. Sau đú vector tỏi tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ đƣợc nuụi cấy trong mụi trƣờng thớch hợp. Cuối cựng qua cỏc bƣớc tỏch chiết DNA, ngƣời ta sẽ thu đƣợc một lƣợng lớn vector. Vector sử dụng là plasmid

Cỏc nhõn tố nhƣ vector, tế bào chủ cú thể thay đổi nhƣng tiến trỡnh tỏch dũng núi chung đƣợc thực hiện qua 4 bƣớc: xử lý DNA cần tạo dũng, tạo vector tỏi tổ hợp, biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dũng.

- Xử lý DNA cần tạo dũng:

Trƣớc hết DNA cần tạo dũng đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mụ̀i đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đú đƣợc làm sạch để thu đƣợc phõn đoạn DNA cú kớch thƣớc nhƣ mong muốn, loại bỏ mụ̀i và cỏc thành phần khỏc trong phản ứng PCR. Bƣớc này nhằm tạo điều kiện cho bƣớc chọn dũng đƣợc thực hiện nhanh và hiệu quả, trỏnh những plasmid tỏi tổ hợp cú kớch thƣớc khụng mong muốn.

- Tạo vector tỏi tổ hợp:

Vector tỏi tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cỏch gắn gen quan tõm (đoạn DNA cần tạo dũng) vào vector tỏch dũng. Thụng thƣờng, sau khi chạy PCR với enzyme Taq polymerase, enzyme này sẽ gắn thờm một nucleotide là Adenin vào đầu 3’ của đoạn gen đƣợc nhõn lờn. Lợi dụng tớnh chất này cỏc nhà khoa học đó nghiờn cứu thiết kế cỏc thế hệ vector tỏch dũng cú mang một nucleotide là Thymin ở đầu 5’ của vector đó đƣợc mở vũng sẵn tại vựng nhõn dũng đa điểm cắt. Hiện nay, cú rất nhiều vector tỏch dũng cú đặc tớnh này, nhƣ pCR2.1-TOPO, pGEM-T, pTZ57R/T, ...

Vector tỏch dũng và DNA cần tạo dũng đƣợc trộn chung theo một tỷ lệ nhất định dƣới sự xỳc tỏc của enzyme T4 ligase, DNA sẽ đƣợc gắn vào vector theo nguyờn tắc bổ sung A-T tại vị trớ mở vũng.

- Biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào chủ:

Trong quỏ trỡnh gắn gen vào vector sẽ hỡnh thành nờn cỏc vector tỏi tổ hợp khỏc nhau. Bƣớc này nhằm mục đớch sử dụng bộ mỏy của tế bào chủ để

sao chộp vector tỏi tổ hợp thành một số lƣợng lớn bản sao. Tuỳ vào mục đớch sử dụng, ngƣời ta sẽ chọn tế bào chủ là tế bào E. coli hay tế bào nấm men.

- Chọn dũng:

Chọn lọc vi khuẩn tỏi tổ hợp theo hai cỏch thụng dụng: chọn lọc theo phƣơng phỏp khỏng khỏng sinh (kanamycin hoặc ampicillin) nhằm loại trừ cỏc tế bào vi khuẩn khụng đƣợc biến nạp và cỏc loại vi khuẩn nhiễm tạp khỏc và chọn lọc theo phản ứng với cơ chất (X-gal/IPTG) nhằm loại trừ những vi khuẩn cú mang vector nhƣng khụng cú đoạn gen đƣợc chốn vào.

1.3.4. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Hiện nay, cú rất nhiều phƣơng phỏp để xỏc định tế bào vi khuẩn cú plasmid mang gen mong muốn hay khụng, nhƣ phƣơng phỏp colony-PCR, cắt plasmid bằng cỏc enzyme hạn chế, hoặc PCR từ plasmid. Trong đú phƣơng phỏp colony-PCR cho phộp phỏt hiện nhanh khuẩn lạc mang plasmid tỏi tổ hợp mong muốn. Phƣơng phỏp này cú ƣu điểm là nhanh, ớt tốn kộm và đơn giản. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc ứng dụng rất rộng rói trong nghiờn cứu sinh học phõn tử.

Nguyờn tắc kỹ thuật colony-PCR dựa trờn nguyờn tắc kỹ thuật PCR, chỉ khỏc ở chỗ mẫu DNA đƣợc thay bằng DNA plasmid giải phúng từ khuẩn lạc. ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phỏ vỡ, giải phúng plasmid tỏi tổ hợp. Plasmid tỏi tổ hợp này sẽ làm khuụn cho phản ứng PCR nhõn gen bằng cặp mụ̀i đặc hiệu.

1.3.5. Kỹ thuật xỏc định trình tự nucleotide

Những phƣơng phỏp đọc trỡnh tự axit nucleic đang đƣợc sử dụng hiện nay đều đƣợc cải tiến từ phƣơng phỏp enzyme học thụng qua việc sử dụng cỏc dideoxynucleotide của Sanger và cs (1977). Phƣơng phỏp này dựa vào

sự tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ sung cho trỡnh tự DNA mạch đơn cần xỏc định. Đặc trƣng của phƣơng phỏp là ngoài bốn loại nucleotide thụng thƣờng cũn sử dụng thờm bốn loại dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong đú nhúm 3’OH đƣợc thay bằng H. Điều này khiến cho cỏc dideoxynucleotide khụng cũn khả năng hỡnh thành cỏc cầu nối phosphodiester và do đú ngừng quỏ trỡnh tổng hợp. Trong kỹ thuật đọc trỡnh tự nucleotide tự động, mỗi dideoxynucleotide đƣợc đỏnh dấu bằng một fluochrome cú màu khỏc nhau. Nhƣ vậy, tất cả oligonucleotide cựng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ cú cựng một màu. Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ra một dóy cỏc phõn đoạn DNA hơn kộm nhau một nucleotide. Thiết bị phỏt hiện huỳnh quang (detector) phỏt hiện cỏc băng theo thời gian, băng nào xa nhất đƣợc phỏt hiện trƣớc. Detector phỏt tớn hiệu lờn mỏy tớnh. Detector là một thiết bị khuếch đại tớn hiệu. Kết quả xỏc định trỡnh tự sẽ đƣợc xử lý bằng phần mềm mỏy tớnh chuyờn dụng.

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIấN CƯU

2.1.1. Vật liệu thực vật

Cỏc giống đậu tƣơng đƣơc sƣ dung nghiờn cƣu gụ m giụng đõu tƣơng Thỏi Nguyờn , DT 84, Bản Dốc, Băc Ha, Cỳc Tuyển do Viện Ngụ Trung ƣơng - Đan Phƣơng, Hà Tõy cung cấp.

Bảng 2.1. Nguụ̀n gốc, đăc điờm của 5 giống đậu tƣơng nghiờn cứu

TT Tờn giống Ký hiờu Nguồn gốc Đặc điểm 1 Thỏi Nguyờn TN Thỏi Nguyờn

Thơi gian sinh trƣơng 75 ngày. Cõy cao 51,6cm. Thơi gian ra hoa 33 ngày 2 DT84 DT84 Viờn di

truyờn

Thơi gian sinh trƣơng85 ngày. Cõy cao 35,8 cm. Thơi gian ra hoa34 ngày 3 Bản Dốc BD Cao Băng

Thơi gian sinh trƣơng 84 ngày. Chiờu cao cõy 57,2 cm. Thơi gian ra hoa 40 ngày

4 Vàng Băc

Hà BH Yờn Bai

Thơi gian sinh trƣơng 88 ngày. Chiờu cao cõy 71,8 cm. Thơi gian ra hoa 41 ngày

5 Cỳc

Tuyờn CT

Băc Giang

Thơi gian sinh trƣơng 75 ngày. Chiờu cao cõy 55,0 cm. Thơi gian ra hoa 35 ngày

2.1.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiờn cứu

Hóa chất: Dựng cho cỏc thớ nghiệm phõn tớch hoỏ sinh và sinh học học phõn tử: gụ̀m cỏc loại hoỏ chất mua của cỏc hóng Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc: EDTA, CTAB, TAE, Agarose, …

Cỏc húa chất thụng dụng khỏc: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol (70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, nƣớc khử ion, NaH2PO4, Fe2( SO4), K3Fe( CN)6, CuSO4, ninhydrin, …

Thiết bị: Cỏc thiết bị chớnh đƣợc sử dụng để phõn tớch hoỏ sinh và sinh học phõn tử gụ̀m: Mỏy điện di + bộ nguụ̀n PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), bể ổn nhiệt (Techne, OSI, Anh), cõn điện tử (Thuỵ Sỹ), tủ lạnh sõu - 850C (Sanyo, Nhật Bản), nụ̀i khử trựng (Tomy- Nhật), tủ sấy (Anh), mỏy PCR (ABI System, Mỹ), mỏy li tõm lạnh (Đức), mỏy khuấy trộn Voltex (Đức), lũ vi súng, box cõy và một số cỏc thiết bị cõn khỏc.

Địa điểm nghiờn cứu: Cỏc thớ nghiệm đƣợc thực hiện tại Phũng Cụng nghờ tờ bào Thực vật, Viện Cụng nghệ sinh học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Viờt Nam.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CƯU

2.2.1. Đỏnh gớa khả năng chịu hạn ở giai đoạn cõy non bằng phƣơng phỏp gõy hạn nhõn tạo

Phƣơng phỏp đỏnh giỏ nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cõy non đƣợc tiến hành theo Lờ Trần Bỡnh và cs (1998) [1].

Hạt đậu tƣơng nảy mầm gieo vào cac chậu trụng cõy chứa cỏt vàng sạch. Thời gian đầu tƣới nƣớc cho đủ ẩm, khi cõy đậu tƣơng đƣợc 3 lỏ thõt, tiến hành gõy hạn nhõn tạo băng cach khụng tƣơi nƣơc và trong qua trinh gõy hạn khụng để nƣớc mƣa vào chậu th ớ nghiệm . Theo doi mƣc đụ heo của cõy trong vong 3, 5, 7 ngày kể từ khi lụ thớ nghiệm bắt đầu cú cõy hộo , tỉ lệ cõy

phục hụ̀i sau 3, 5, 7 để đỏnh giỏ khả năng chịu hạn của cỏc giống đậu tƣơng bằng cỏch xỏc định tỷ lệ thiệt hại và chỉ số chịu hạn tƣơng đối.

Cỏc chỉ tiờu phõn tớch gụ̀m : - Tỷ lệ cõy khụng hộo - Tỷ lệ cõy phục hụ̀i

- Chỉ số chịu hạn tƣơng đối.

Khả năng chịu hạn tƣơng đối của cõy đƣơc biờ u hiờn băng đụ thi hinh rada, gụm cac truc a, b,c, d, e, g, h, i, k, l, m và mang cỏc trị số tƣơng ứng an, bn,cn dn, en, gn, hn, in, kn, ln, mn và chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc tớnh bằng đụ̀ thị rada theo cụng thức :

Cỏc trị số: Số cõy chết: trị số 3; Số cõy hộo: trị số 1; Số cõy khụng bị ảnh hƣởng: trị số 0.

- Chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc tớnh theo cụng thức:

Sn = 1 sinα (ab +bc +cd +de +eg +ga) 2

Gúc α đƣơc tao bơi2 trục mang trị sụ gõn nhau va α = 360/6 =600 Sn : chỉ số chịu hạn tƣơng đối

n : Ký hiệu cỏc giống nghiờn cứu Cỏc chỉ tiờu theo dừigụm:

a: % cõy khụng heo sau3 ngày hạn b: % cõy phuc hụisau 3 ngày hạn c: % cõy khụng heo sau5 ngày hạn d: % cõy phuc hụi sau5 ngày hạn e: % cõy khụng heo sau7 ngày hạn g: % cõy phuc hụi sau7 ngày hạn

2.2.2. Xử lý kết quả và tớnh toỏn số liệu

Cỏc số liệu đƣợc xử lý trờn mỏy vi tớnh bằng chƣơng trỡnh Excel với mức ý nghĩa α = 0,05.

2.2.3. Phƣơng phỏp sinh học phõn tử

2.2.3.1. Phương phỏp tỏch chiết ARN tổng số

Quả đậu tƣơng ở g iai đoan con non đƣơc đem bao quản ở tủ lạnh sõu (- 850C). Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen) để tỏch chiết RNA tổng số từ hạt đậu tƣơng non theo h•ớng dẫn của hãng sản xuất.

Quy trình tỏch chiết ARN tổng số đƣơc thực hiện theo cỏc bƣớc sau:

- Lấy quả đậu tƣơng đó để lạnh ở -850C tỏch lõy hat và nghiền nhanh

trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải đƣợc nghiền triệt để và trỏnh enzyme RNase cắt RNA.( Nghiờn băng cối và chày sƣ đó đƣợc vụ trựng ).

- Chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2ml.

- Bổ sung 1ml Trizol Reagents, đảo đều ở nhiệt độ phũng (15 – 300C) trong 5 phỳt.

- Bổ sung 200àl Chloroform : Isoamyl (24 : 1), đảo đều ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt.

- Ly tõm 40C, 11000 v/p trong 15 phỳt.

- Hỳt 500àl dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.

- Bổ sung 500àl Isopropanol đó đƣợc làm lạnh đến 40C, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa.

- Để ở nhiệt độ phũng trong 10 phỳt, ly tõm 11000 v/p trong 15 phỳt. - Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng cụ̀n 70% pha trong DEPC 0,01%.