Cystatin thực vật đƣợc mụ tả lần đầu tiờn ở lỳa vào năm 1987 bởi Abe và cs. Cystatin thực vật là một đối tƣợng đƣợc tập trung nghiờn cứu nhiều nhất từ hơn vài thập kỷ trƣớc trở lại đõy. Khi stress han xay ra , mụt sụ protein bị biến tớnh và tổn thƣơng. Cysteine protease tham gia loại bỏ cỏc protein biến tớnh. Cysteine protease là enzyme cú vai trũ thiết yếu trong quỏ trỡnh sinh trƣởng và phỏt triển của thực vật, sự già và chết theo chƣơng trỡnh của tế bào, trong sự tớch lũy protein dự trữ trong hạt, huy động protein dự trữ và khả năng chống chịu với những stress của mụi trƣờng. Cysteine protease tham gia vào sự hoàn thiện protein, tỏi tạo protein và loại bỏ protein biến tớnh nhằm giỳp cõy thớch ứng với những tỏc động của mụi trƣờng bờn ngoài. Quỏ trỡnh này cú thể bị cản trở bởi cỏc chất ức chế cysteine protease (đƣợc gọi là cystatin) [30], [38].
Vờ cấu trỳc, cystatin thực vật hay cũn gọi là phytocytatin (Kondo et al., 1991) [52] là cỏc chất ức chế protein cạnh tranh thuộc họ enzyme phõn huỷ (Cys protease) Cys C1A (giống nhƣ papain) cú nhỏnh với liờn họ cystatin, cú tờn viết chung là Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly kiờu nằm trong khu vực trung tõm của chuỗi peptide (mà Xaa là bất kỳ một axit amin nào), một Pro-rp (hay Leu- Trp) dipeptide kiờu nằm ở khu vực đầu C-terminal và một đầu Gly trong khu vực N-terminal [23], [47]. Cấu trỳc bậc ba của ozycystatin là cystatin thực vật đầu tiờn đƣợc nghiờn cứu sõu nhất (Abe et al., 1987; Arai et al., 2000) [20], [21] chứa 5 dải β chứa cỏc chuỗi đối song bọc quanh xoắn kộp α tƣơng tự nhƣ xoắn bậc ba trong cystatin động vật (Nagata et al., 2000) [53]. Cystatin ức chế hỡnh thành nờn một phức hợp đụ̀ng đẳng vờ cõu truc phõn tử ngƣợc với enzyme phõn giải Cys, đúng vai trũ nhƣ chõt nền để xõm nhập vào miền hoạt húa của enzyme đớch và ngăn chặn việc đi vào cỏc nền protein khỏc. Từ cỏc cấu trỳc và chức năng của mụ hỡnh cystatin động vật, hoạt tớnh ức chế của những protein này cú đƣợc bởi cấu trỳc khụng gian ba chiều hỡnh thành nờn dạng hỡnh cha c ba đƣợc cắm vào trong miền hoạt húa enzyme đớch (Bode et al., 1988; Stubbs et al., 1990) [25], [49]. Thành phần cấu trỳc đầu tiờn, mà cú tƣơng tỏc vật lý với cỏc miền hoạt húa đớch, cú chứa vũng kẹp túc bề mặt mang kiờu bảo thủ Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly (tƣ Gln-53 đến Gln-57 trong cystatin lũng trắng trứng). Thành phần thứ hai, cũng đi vào miền hoạt húa cú chứa một vũng kẹp túc bề mặt trong khu vực C-terminal chứa kiờu bảo thủ Pro (Leu)-Trp (Pro-103 và Trp-104 trong cystatin trứng). Thành phần thứ ba, nằm trong khu vực N-terminal, chứa đoạn bảo thủ Gly (Gly-9 trong cystatin của trứng) đặc trƣng cho khả năng hoạt động ức chế. Phần protein này khụng xõm nhập vào khe hoạt húa, nhƣng lại đúng gúp rất đỏng kể tới quỏ trỡnh liờn kết và ảnh hƣởng mạnh tới tinh đặc hiệu của Cystatin với enzyme phõn hủy protein Cys (Cys protease).
Cỏc đoạn ức chế bảo thủ giữa cystatin động vật và thực vật, cấu trỳc xoắn bậc 3 đƣợc chiết từ cystatin lũng trắng trứng gà, stefin ở ngƣời, oryzacystatin và miền ức chế thứ 2 của đa cystatin ở khoai tõy đa chứng tỏ rằng cú một cơ chế ức chế bảo thủ đối với cystatin động vật và thực vật, liờn quan đến hai vũng kẹp túc nhƣ là yếu tố quyết định cơ bản của miền hoạt húa đớch và sự ức chế.
Chức năng của hầu hết cystatin thực vật là khả năng ức chế enzyme phõn hủy protein Cys nhƣ papain, cấu trỳc bậc ba bảo thủ mạnh của chỳng và kiờu ức chế protease, khả năng phõn bố phổ biến trong thực vật chứng tỏ vai trũ điều tiết protease quan trọng của những protein này trong thực vật. Cỏc cấu trỳc phức hợp của cystatin trong hờ gen thực vật, mó húa đặc trƣng cho cỏc đột biến đa ức chế với cỏc biểu hiện riờng biệt và phổ đụ̀ng đều cho Cys protease, chứng tỏ sự đa dạng của cỏc chức năng.
Phytocystatin cú rất nhiều cỏc chức năng sinh học: (a) Cỏc chức năng sinh lý của sự hoạt động của enzyme proteinase trong hạt trong suốt quỏ trỡnh hạt chớn. (b) Sự đúng gúp của cỏc chất gõy ức chế đúng vai trũ quan trọng trong việc chống lại sự tấn cụng của cụn trựng, giun trũn mà nhỡn chung cú chứa cysteine proteinase bờn trong ruột của chỳng. (c) Một số chức năng khỏc chƣa đƣợc xỏc định.
Phytocystatin tham gia vào việc kiểm soỏt cysteine proteinsase endogenous trong suốt quỏ trỡnh chớn và sự nảy mầm của hạt (Abe and Arai, 1991) [22]. Oryzacystatin đƣợc xem nhƣ là chất gõy ức chế cysteine proteinase oryzain α, β, γ đƣợc sinh ra trong suốt quỏ trỡnh này mầm. Proteinase của ngụ và Zein đƣợc ức chế bởi cystain của ngụ, đƣợc cho rằng cú sự liờn quan đến chất ức chế trong cơ chế khỏng endogen (Steller, 1995) [54]. Hai chất gõy ức chế cysteine proteinase trong đậu tƣơng là L1 và R1 cũng đƣợc kiểm tra khỏng lại cysteine proteinase thực vật từ đậu hai lỏ mầm,
về căn ban , R1 cú hoạt tớnh ức chế mạnh hơn L1 (Botella et al., 1996) [27]. Phytocystatin và cysteine proteinase cần thiết cho sự phỏt triển của thực vật và sự lóo húa của chỳng. Thực vật lờn chƣơng trỡnh cho cỏc tế bào chết là do ngầm định bởi một vài quỏ trỡnh bờn trong thực vật nhƣ xylogenesis, một số dạng của senescence, do sự tấn cụng của mầm bệnh và đỏp ứng của tỏc động ngoại cảnh. Gần đõy, cysteine proteinase đƣợc nghiờn cứu và cho rằng chỳng điều khiển sự biểu hiện của cỏc gen ức chế proteinase đặc hiệu trong tế bào đậu tƣơng (Groover et al.,1997) [55] nhƣ Sbcys là một chất ức chế cysteine proteinase.
Việc điều khiển phiờn mó trong quỏ trỡnh sinh tổng hợp cystatin cũng đúng vai trũ nhất định trong lỏ và cỏc cơ quan hoạt húa trao đổi chất khỏc, việc kiểm soỏt Cys proteinase liờn quan đến rất nhiều cỏc quỏ trỡnh khỏc nhau bao gụ̀m quy trỡnh tỏi tạo protein trong sự già đi và sự kớch hoạt của cỏc quỏ trỡnh tổng hợp dƣới cỏc tỏc động vụ sinh.
Cỏc bằng chứng chứng tỏ rằng vai trũ của cystatin trong cơ chế đề khỏng của thực vật chống lại cỏc tỏc nhõn khỏng khỏng sinh. Cỏc gen mó húa sự tăng cƣờng hoạt động của cystatin bởi cỏc tớn hiệu liờn quan đến khả năng khỏng khỏng sinh nhƣ cỏc cụn trựng ăn cỏ, cỏc tổn thƣơng ngoài hoặc cỏc loại nấm đó đƣợc nghiờn cứu và cụng bố.
Một số cỏc nghiờn cứu về biểu hiện gen đó thiết lập một tƣơng quan rừ ràng giữa việc tớch trữ protein, sinh tổng hợp cystatin và sự suy giảm sự hoạt động của cỏc Cys-proteinase trong cỏc cơ quan dự trữ. Cỏc nghiờn cứu tỏch dũng gen và cỏc tớnh chất cơ bản của oryzacystatin (Abe et al., 1991) [22] đó chứng minh rằng sự tớch lũy của mRNA cystatin trong giai đoạn phỏt triển của hạt hai tuần sau khi nở hoa và một tuần trƣớc khi quỏ trớnh tạo glutelin. Cystatin ức chế đƣợc tổng hợp ngay trong giai đoạn phỏt triển sớm của hạt hoặc cỏc cơ quan dự trữ sinh dƣỡng để cuối cựng tạo ra số lƣợng lớn hơn Cys protease và thỳc đẩy việc tạo ra cỏc protein dự trữ. Một lƣợng cõn bằng cao
giữa cystatin/Cys proteinase đƣợc duy trỡ bờn trong cơ quan dự trữ cho phộp tạo nờn sự tớch trữ protein đƣợc duy trỡ trong cỏc cơ quan trong trạng thỏi chƣa hoạt động sẵn sàng cho việc nảy mầm trƣớc khi quỏ trỡnh nảy mầm thực sự xảy ra. Cỏc thụng tin cho chỳng ta thấy sự tƣơng tỏc giữa enzyme cysteine proteinase và chất ức chế cystatin là một yếu tố quan trọng trong khả năng đề khỏng của thực vật. Thực tế này mở ra cỏc nghiờn cứu với cỏc ứng dụng cơ bản và thực tế mà cú thể sử dụng trong nhõn giống thực vật để cú thể sản xuất ra cỏc chõt ƣc chờ thực vật , đặc biệt là với cystatin thực vật bằng cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp.
1.2.2. Gen mó hóa Cystatin ở thực vật và cõy đậu tƣơng
Gen cystatin ở thực vật mó húa cho cystatin ức chế enzyme phõn hủy cystein (ký hiệu là phytocystatin). Hầu hết cỏc phytocystatin là cỏc protein nhỏ, trong khoảng kớch thƣớc từ 12 - 16 kDa, trong đú cú một nhúm khỏc biệt rừ ràng cú khối lƣợng phõn tử cao hơn hẳn (23 kDa), do đầu C-terminal mở rộng. Cỏc Cystatin sở hữu một trỡnh tự duy nhất và bảo thủ LARFAVDEHN ở đầu N-terminal của đoạn xoắn α-helix.
Đến nay, đó cú rất nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu về phõn lập, biểu hiện gen Cystatin từ nhiều loài cõy trụ̀ng khỏc nhau. Kết quả cho thấy gen cystatin ở cỏc loài cõy trụ̀ng khỏc nhau cú kớch thƣớc rất khỏc nhau nhƣng chỳng đều mó húa cho phytocystatin cú vai trũ ức chế enzyme cysteine proteinase và cú tớnh chất bảo thủ cao .
Misaka và cs (1996), đó nghiờn cứu phõn lập thành cụng cDNA của gen mó húa cho cystatin từ cõy Đậu tƣơng. Đoạn cDNA này cú kớch thƣớc 1175 nucleotide với trỡnh tự mó húa cú chiều dài 737 nucleotide bắt đầu từ vị trớ 48 đến
785 mó húa cho chuỗi polypeptide dài 245 axit amin (mó số BAA19608) [33].
To và cs (2001), đó phõn lập thành cụng mRNA của gen mó húa cho
cystatin từ cõy khoai lang (Ipomoea batatas). Đoạn mRNA này cú kớch thƣớc
1126 nucleotide với trỡnh tự mó húa dài 764 nucleotide bắt đầu từ vị trớ 143 đến
907 mó húa cho chuỗi polypeptide dài 254 axit amin (mó số AF117334.1) [37].
Kamel Gaddour và cs (2001), đó phõn lập thành cụng cDNA mó húa cho cystatin từ cõy lỳa mạch. Cho thấy trỡnh tự nucleotide của gen rất bảo thủ giữa cỏc thành viờn trong họ cystatin. Gen này nằm trờn NST số 2, đƣợc biểu hiện trong phụi, trong nội nhũ đang phỏt triển, lỏ và rễ đƣợc thể hiện qua cỏc kết quả lai northern và western blot.
Tripp và cs (2002), đó phõn lập thành cụng cDNA của gen mó húa cho cystatin từ cõy Arabidopsis thaliana. Đoạn cDNA này cú kớch thƣớc 714 nucleotide với trỡnh tự mó húa dài 606 nucleotide bắt đầu từ vị trớ 1 đến 606 mó húa cho chuỗi polypeptide dài 201 axit amin (mó số AAN65082) [36].
Ở cõy đậu xanh gen cystatin đƣợc Kang và cs (2002), phõn lập, đọc trỡnh tự từ mRNA và cụng bố tại ngõn hàng gen Quốc tế cú mó số AF454396 với kớch thƣớc 304 nucleotide, đoạn mó hoỏ gụ̀m 267 nucleotide mó hoỏ 88 axit amin.
Theo Silvia Valdes-Rodriguez và cs (2007), đó phõn lập thành cụng đoạn cDNA mó húa cho cystatin (ký hiệu là AhCPI) từ hạt cõy Amaranthus hypochondriacus. Đoạn cDNA phõn lập đƣợc cú kớch thƣớc 1016 nucleotide với một khung đọc mở chứa 741 nucleotide mó húa cho đoạn polypeptide dài 247 axit amin và hai vựng khụng dịch mó (untranslated region- UTR) gụ̀m đoạn đầu 5' dài 84 nucleotide và đoạn đầu 3' dài 191 nucleotide. Trỡnh tự cDNA trờn cú chứa 2 khung đọc với bộ ba mở đầu ATG nằm ở vị trớ 85 và 208. Đoạn nucleotide này đó đƣợc đăng ký trờn ngõn hàng GenBank với mó số là DQ792503 [35].
Cystatin là chất ức chế hoạt động của cysteine proteinase. Gen cystatin là gen đó đƣợc khẳng định cú mối liờn quan với khả năng chịu hạn của thực vật. Cystatin và gen mó húa cystatin cũng đó đƣợc nghiờn cứu ở cõy đậu xanh
(2008) đa nhõn bản gen cystatin ở cõy lỳa từ ADN tổng số bằng kỹ thuật PCR, tỏch dũng thành cụng gen cystatin từ cỏc giống lỳa nghiờn cứu cú kớch thƣớc phõn tử khoảng 680 bp [3].
Chan và cs (2008), cũng đó phõn lập thành cụng cDNA của gen mó húa cho cystatin từ cõy Thầu dầu (castor bean- Ricinus communis). Đoạn cDNA này cú kớch thƣớc 957 nucleotide với trỡnh tự mó húa dài 716 nucleotide bắt đầu từ vị trớ 32 đến 748 mó húa cho chuỗi polypeptide dài 238 axit amin (mó số XP 002525552) [28].
Khi điều kiện bất lợi xảy ra nhƣ hạn hỏn thỡ protein thƣờng bị biến tớnh, tế bào bị tổn thƣơng nờn cysteine proteinase tham gia vào quỏ trỡnh loại bỏ protein biến tớnh làm cho cõy thớch nghi với tỏc động của hạn. Hoạt động của cysteine protease lại bị ức chế bởi cystatin. Vỡ vậy, phõn lập gen cystatin nhằm tạo cơ sở cho việc nghiờn cứu làm giảm sự tớch luỹ cystatin là rất cần thiết.
1.3. ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TƯ TRONG PHÂN LẬP GEN
Enzyme phiờn mó ngƣợc là một trong những enzyme cú vai trũ quyết định trong quỏ trỡnh hỡnh thành ngành sinh học phõn tử, enzyme này do cỏc retrovirus sản sinh nhằm sao chộp hờ gen RNA của chỳng trong tế bào chủ. Cỏc enzyme phiờn mó ngƣợc thƣờng đƣợc sử dụng là những enzyme cú hoạt tớnh 5' -
3' DNA polymerase sử dụng sợi mRNA làm khuụn mẫu với đoạn mụ̀i là đoạn
RNA hoặc DNA cú đầu 3'-OH tự do để sao chộp ngƣợc tạo ra sợi cDNA.
1.3.1. Kỹ thuật tổng hợp cDNA và nhõn gen
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) là sự kết hợp của hai phản ứng sao mó ngƣợc (reverse transcription) và PCR để nhõn lờn một đoạn gen quan tõm từ RNA.
(1) Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
Nguyờn lý của phƣơng phỏp này là sử dụng enzyme sao mó ngƣợc để tổng hợp nờn sợi cDNA thứ nhất từ RNA. Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thỳc phản ứng ta sẽ thu đƣợc lƣợng cDNA tƣơng ứng với lƣợng RNA khuụn ban đầu. Để tăng hiệu quả của quỏ trỡnh tổng hợp, lƣợng mụ̀i đƣợc cho vào lớn hơn rất nhiều lƣợng RNA khuụn và chất kỡm hóm RNase cũng đƣợc đƣa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị cắt bởi RNase. Cấu trỳc mũ đầu 5' Cấu trỳc mũ đầu 5' mRNA dNTP Reverse transcriptase
AAA(A)n đuụi poly(A) đầu 3'
3'-OH 5'
Oligo(dT)12-18 primer AAA(A)n đuụi poly(A) đầu 3'
5' 3' 3'-OH 5' Oligo(dT)12-18 primer
cDNA : mRNA
AAA(A)n đuụi poly(A) đầu 3'
Hỡnh 1.3. Sơ đụ̀ phản ứng tổng hợp cDNA
(2) Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuụn để khuếch đại gen quan tõm bằng phản ứng PCR với cặp mụ̀i đặc hiệu.
Kỹ thuật PCR đƣợc Mullis và cs mụ tả đầu tiờn năm 1985. Đõy là kỹ thuật in vitro tƣơng đối đơn giản cho phộp nhõn nhanh một số lƣợng khụng hạn chế nguyờn bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xỳc tỏc của DNA polymerase. Tất cả cỏc DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuụn đều cần sự hiện diện của những mụ̀i đặc hiệu. Mụ̀i là những đoạn DNA ngắn cú khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuụn. DNA polymerase cú chức năng nối thờm cỏc nucleotide vào trỡnh tự mụ̀i để hỡnh thành mạch DNA mới. Quỏ trỡnh nhõn bản bằng enzyme này bao gụ̀m 3 bƣớc đƣợc lặp lại nhiều lần:
- Biến tớnh DNA từ dạng sợi kộp thành dạng sợi đơn bằng cỏch nõng cao nhiệt độ lờn 94-950C trong khoảng thời gian 30 giõy đến 1 phỳt.
- Gắn mụ̀i với đoạn DNA cần khuyếch đại thụng qua hạ nhiệt độ xuống 40-600C, trong khoảng thời gian 30 giõy đến 1 phỳt, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ (G + C)/(A + T) của đoạn mụ̀i.
- Phản ứng polymerase tổng hợp phõn tử DNA kộo dài từ đầu 3' - OH của mụ̀i. Hai phõn tử DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyờn tắc bổ sung từ hai đầu của phõn tử DNA làm khuụn. Thời gian kộo dài từ 30 giõy đến vài phỳt. Để trỏnh hiện tƣợng bắt cặp khụng đặc thự, phản ứng tổng hợp nờn đƣợc thực hiện ở
720C. Nhƣ vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lƣợng DNA cần nhõn bản sẽ tăng gấp
đụi, với N sợi khuụn ban đầu sau n chu kỳ sẽ cú Nx2n sợi DNA đƣợc nhõn lờn.
1.3.2. Kỹ thuật biến nạp plasmid vào E. coli
Plasmid là những phõn tử DNA cú kớch thƣớc nhỏ (2 – 5 Kb) dạng vũng, cú khả năng tỏi bản độc lập, khụng phụ thuộc vào sự tỏi bản của bộ gen tế bào. Trong sinh học phõn tử, plasmid đƣợc ứng dụng trong tỏch dũng gen nhằm nhõn nhanh một số lƣợng khụng hạn chế gen quan tõm của một khuẩn lạc đó đƣợc biến nạp. Plasmid sử dụng trong sinh học phõn tử phải đảm bảo cỏc yờu cầu sau: (i) kớch thƣớc nhỏ; (ii) cú gen chỉ thị cho phộp dễ dà ng phỏt hiện, nhận biết plasmid trong tế bào vi khuẩn (thƣờng là gen khỏng khỏng sinh hoặc gen tổng hợp chất màu); (iii) cú vị trớ nhận biết duy nhất của nhiều enzyme giới hạn. Một số plasmid đƣợc sử dụng nhiều trong tỏch dũng gen là