A.oryzae là loài hô hấp hiếu khí vì vậy việc cung cấp oxy đầy đủ trong quá trình sinh trưởng và phát triển là yêu cầu quan trọng và cần thiết. Lượng oxy cung cấp tỷ lệ với độ dầy của môi trường nhân giống. Vì vậy tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của độ dày môi trườngkhác nhau: 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40cm.
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của độ thoáng khí trong quá trình lên men
đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Stt Độ dày (cm) Hoạt tính AGIs (%) 1 5 62,50e 2 10 71,20d 3 15 75,40c 4 20 78,18a 5 25 78,18a 6 30 75,87b 7 35 59,43f 8 40 50,20g
(Ghi chú :a,b,c,d,e,f,g thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở
mức ý nghĩa α = 0,05)
Qua bảng 4.4 chúng ta thấy độ thoáng khí ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh hoạt chất của chủng A.oryzae T6. Khi nghiên cứu độ dày môi trường lên
men từ 5 - 25cm thì hoạt tính AGIs dao động từ 62,5 - 78,18% và ở độ dày 20cm và 25cm thì khả năng sinh hoạt chất của nó là lớn nhất (đạt78,18%). Tuy nhiên độ dày từ 30cm thì lượng hoạt chất sinh ra lại giảm xuống là 75,87%, ta tiếp tục tăng độ dày thì hoạt chất giảm xuống còn 50,2%. Lượng hoạt chất AGIs sinh ra khác nhau như vậy có thể giải thích vì A.oryzae hô hấp hiếu khí và phát triển trong điều kiện thoáng khí. Nếu bề mặt môi trường không đảm bảo sự thoáng khí, độ dày môi trường lớn sẽ dẫn đến thiếu sự lưu thông oxy và, nấm mốc phát triển cục bộ. Một lượng nhỏ khí carbon là cần thiết cho chủng này phát triển nhưng nếu nồng độ này quá cao lại kìm hãm sự
phát triển của chúng. Từ đó chúng tôi lựa chọn độ dày lên men là 25cm vì ở đồ dày này vẫn đảm bảo độ thoáng khí và tiết kiệm diện tích lên men. Vì vậy chúng tôi chọn độ dày lên men là 25cm.
4.1.5. Ảnh hưởng lượng giống nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Lượng giống ban đầu có ảnh hưởng đến quá trình lên men của nấm mốc. Nếu lượng giống ban đầu quá ít sẽ kéo dài thời gian lên men và tạo cơ hội cho các vi sinh vật khác phát triển. Ngược lại nếu lượng giống ban đầu quá lớn sẽ làm tăng chi phí nhân giống ngoài ra còn làm thay
đổi tỷ lệ sản phẩm phụ tạo thành ảnh hưởng đến khả năng thu nhận hoạt chất. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát lượng mốc giống ban đầu cho quá trình lên men để đạt hiệu quả thu nhận hoạt AGIs cao nhất. Kết quả
Bảng 4.5 Ảnh hưởng lượng giống nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Stt Lượng giống nấm mốc ban
đầu cho lên men
Hoạt tính AGIs (%) 1 102 63,20g 2 103 64,78f 3 104 68,40e 4 105 76,17b 5 106 78,21a 6 107 78,08a 7 108 72,70c 8 109 71,83d
(Ghi chú:a,b,c,d,e,f thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở
mức ý nghĩa α = 0,05)
Từ bảng 4.5 chúng ta thấy, với lượng giống khác nhau thì khả năng sinh tổng hợp hoạt chất khác nhau dao động từ 63,2 - 78,21% (Khi lượng giống từ 102- 109 cfu/g). Và ở lượng giống ban đầu 106 cfu/g khả năng sinh tổng hợp hoạt chất ức chế là cao nhất đạt 78,21%. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Shie-Jea Lin, Li-Lin Chen, Chiou Wen- Yen, Wen-Shen
Chu. Vì vậy trong quá trình sản xuất chúng tôi bổ sung lượng giống ban đầu là (106 cfu/g).
4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu của môi trường đế khả năng sinh hoạt chất AGIs hoạt chất AGIs
Dựa vào khả năng sinh trưởng và phát triển rất tốt trên môi trường cám gạo chúng tôi tiến hành thí nghiệm kết hợp hai loại nguyên liệu lên men A.
oryzae T6 để A.oryzae T6 vừa có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất vừa có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs cao nhất. Tức là tiến hành thí
nghiệm bổ sung cám gạo vào môi trường đậu đen xanh lòng để tiến hành lên men theo các tỷ lệ khác nhau như (đậu đen xanh lòng/cám gạo): 100/0; 95/5; 90/10; 85/15; 80/20; 75/25. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu đến khả năng lên men của chủng A.oryzae T6 được thể hiện trong bảng 4.6.
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu của môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Stt Tỷ lệ đậu đen xanh lòng/cám gạo Hoạt tính AGIs (%) 1 100/0 62,33e 2 95/5 78,18b 3 90/10 79,24a 4 85/15 74,53c 5 80/20 68,27d 6 75/25 63,37e
(Ghi chú: a,b,c,d,e thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở
mức ý nghĩa α = 0,05)
Từ bảng 4.6 ta thấy, khi lên men chủng A.oryzae T6 trên môi trường giống đậu đen xanh lòng có bổ sung cám gạo ở các tỷ lệ khác nhau có khả
năng sinh tổng hợp hoạt tính ức chế enzyme α - glucosidase là khác nhau. Khả năng AGIs dao động trong khoảng 62,33 - 79,24%. Khi lên men
A.oryzae T6 trên môi trường đậu đen xanh lòng có bổ sung 10% cám gạo thì khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs đạt cao nhất (79,24%). Điều này giải thích do, với lượng vừa đủ cám gạo bổ sung sẽ cung cấp đầy đủ các nguồn dinh dưỡng cho chủng sinh trưởng và phát triển. Nhưng nếu lượng cám gạo bổ sung quá nhiều, thì lượng cơ chất không đủ để chủngA.oryzae có thể lên men. Còn quá ít thì không đủ dinh dưỡng cho nấm mốc phát triển tốt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1.7.Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase của chủng A.oryzae T6
Để đậu đen lên men và khả năng sinh hoạt chất AGIs là lớn nhất thì thời gian lên men là rất quan trọng. Tiến hành thí nghiệm lên men qua các thời gian khác nhau và kết quảđược thể hiện qua bảng dưới đây:
Bảng 4.7 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs
Stt Thời gian lên men (h) Hoạt tính AGIs (%)
1 0 0 2 24 44,26q 3 26 46,53o 4 28 47,80s 5 30 51,46x 6 32 55,60l 7 34 61,10k 8 36 63,30n 9 38 66,20m 10 40 68,23i 11 42 70,00h 12 44 73,18g 13 46 76,30f 14 48 79,21e 15 50 80,46e 16 52 81,17e 17 54 82,30d 18 56 85,50c 19 58 87,67a 20 60 86,41b 22 62 86,17b
( Ghi chú : a,b,c,d,e f… thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở mức ý nghĩa α = 0,05)
Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở các thời gian lên men khác nhau thì khả
năng sinh hoạt chất AGIs khác nhau, thời gian tăng cũng cho khả năng sinh tổng hợp AGIs tăng, từ 24 giờ đến 58 giờ hoạt tính AGIs đạt từ 44,26% - 87,67%,sau 58 giờvà hoạt tính AGIs không tăng mà có chiều hướng giảm xuống còn 86,17%. Kết quả có thể giải thích do ban đầu chủng còn non, sinh trưởng nhanh và tăng sinh khối nhanh. Môi trường dinh dưỡng trong thời gian này giàu nguồn carbon, nitơ và phospho vô cơ.Nhưng thời gian lên men càng kéo dài thì môi trường dinh dưỡng cạn dần, sinh khối của tế bào cũng giảm dần nhưng lượng sản phẩm trao đổi chất tích lũy ngày càng tăng.Tuy nhiên, do tế bào bắt đầu tự phân, quá trình tích tụ sản phẩm bị chậm lại và sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng của chủng.
Kết quả này cũng phù hợp với công bố của Jing Chen và cộng sự năm 2007 khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae 3.951. Từ kết quả này cho thấy
A.oryzae T6 lên men trên môi trường đậu đen xanh lòng có bổ sung lượng cám gạo là 10%;độ dày là 25cm; hàm ẩm môi trường 55%; pH 5,5; tỷ lệ
giống tiếp ban đầu là 106 cfu/g và nhiệt độ lên men 300C ở thời gian thích hợp cho tổng hợp hoạt chất AGIs cao là 58 giờ lên men.
4.2.Giải bài toán tối ưu
+Bài toán đặt ra là: Tối ưu hóa bằng thực nghiệm quá trình lên men thu
được hoạt chất AGIs
+Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc thu sinh khối ta lựa chọn các yếu tố chính ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh hoạt chất AGIs.
Bài toán có dạng như sau: Ymax = Y(A,B,C)
Trong đó: Y hàm mục tiêu- lượng hoạt chất AGIs sinh ra
Ymax: Lượng hoạt chất sinh lớn nhất A: Độ ẩm (%); B: Nhiệt độ
(0C); C: Thời gian (h)
Phương trình hồi quy có dạng : Y= b0 + b1A + b2B + b3C + b12AB + b23BC + b13AC + b11A2 + b22B2 + b33C2
Trong đó: b0 là hệ số hồi quy tại tâm b1, b2, b3 là hệ số tuyến tính b12, b23, b13 là hệ số tương tác b11, b22, b33 là các hệ số bậc hai
Mỗi hệ số b đặc trưng cho ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh hoạt chất AGIs.
Hệsố nào có giá trị tuyệt đối lớn nhất thì yếu tố tương ứng sẽ ảnh hưởng đến quá trình nhiều nhất.
Các thí nghiệm được tiến hành 3 lần nhắc lại.Giá trị thí nghiệm là giá trị trung bình.Các số liệu thí nghiệm lên men được xử lí trên phần mềm Design Expert 7.0.ANOVA được dùng để đánh giá tương tác giữa các biến với lượng hoạt chất AGIs sinh ra.Mức độ ý nghĩa của mô hình được đánh giá dựa trên hệ số xác định (R2).Ý nghĩa thống kê được kiểm tra bằng phép thử F (F-test). Bảng4.8 Khoảng biến đổi của các yếu tố Nguyên liệu Biến độc lập Kí tự mã hóa Các cấp độ của biến -1 0 1 Đậu đen xanh lòng Độẩm (%) A 50 55 60 Nhiệt độ (0C) B 25 30 35 Thời gian (h) C 54 58 62
Bảng4.9 Bảng thiết kế ma trận Stt Độẩm (%) Nhiệt độ (0 C) Thời gian (h) Hoạt tính (%) 1 -1 -1 0 2 1 -1 0 3 -1 1 0 4 1 1 0 5 -1 0 -1 6 1 0 -1 7 -1 0 1 8 1 0 1 9 0 -1 -1 10 0 1 -1 11 0 -1 1 12 0 1 1 13 0 0 0 14 0 0 0 15 0 0 0
Bảng 4.10Kết quả thiết kế ma trận Stt Độẩm (%) Nhiệt độ (0C) Thời gian (h) Hoạt tính (%) 1 -1 -1 0 86,456 2 1 -1 0 86,469 3 -1 1 0 86,524 4 1 1 0 87,322 5 -1 0 -1 86,410 6 1 0 -1 86,563 7 -1 0 1 86,640 8 1 0 1 87,469 9 0 -1 -1 86,356 10 0 1 -1 86,735 11 0 -1 1 86,356 12 0 1 1 87,497 13 0 0 0 87,745 14 0 0 0 87,523 15 0 0 0 87,650
Nhận thấy khả năng sinh hoạt chất AGIs (%) tăng trong khoảng 86,356
đến 87,745. Khi ở nhiệt độ 250C, độ ẩm 55%, thời gian 54h thì khả năng sinh hoạt chất là thấp nhất.
Kết quả phân tích phương sai của mô hình trong hình cho thấy nhiệt độ,
Hình 4.1. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình tối ưu lên men (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương trình hồi quy mô tảảnh hưởng của các yếu tốđộc lập (A, B, C) tới khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzaeT6.
Hình 4.2. Phương trình hồi quy mô tảảnh hưởng các yếu tố tới khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryazeT6
Các giá trị hệ số dự đoán và giá trị xác xuất (P - value) tương ứng của mô hình được trình bày trên bảng trên.Giá trị xác xuất được sử dụng để đánh giá mức độ ý nghĩa của các hệ số và mức độ ảnh hưởng của từng biến đến chỉ
tiêu. Giá trị xác xuất ≤ 0,05 (P - value ≤ 0,05) thì hệ số tương ứng có ý nghĩa, giá trị xác xuất lớn ≥ 0,1 (P - value ≥ 0,1 thì hệ số tương ứng không có ý nghĩa. Từ bảng trên cho thấy giá trị của mô hình có P = 0,0005< 0,05 do đó mô hình lựa chọn có thể giải thích các kết quả thí nghiệm. Đồng thời các hệ
hoạt tính thu được. Bên cạnh đó, giá trị lack of fit có P = 0,5346> 0,5 nên mô hình lựa chọn hoàn toàn phù hợp.
Giá trị của các thông số R2, Adj R2, đặc trưng mà mức độ phù hợp của mô hình trong việc giải thích các giá trị thí nghiệm. Giá trị R2= 0,9855 và giá trị Adj R2 = 0,9594 chứng tỏ mô hình lựa chọn là phù hợp để giải thích các kết quả của thí nghiệm, mô hình xây dựng được là phù hợp để dự báo các kết quả
của thí nghiệm.
Giá trị của thông số Pred R2 dùng đểđánh giá khả năng dự báo của mô hình trong các điều kiện thí nghiệm mới nếu sự khác nhau giữa Adj R2 và Pred R2 < 0,2 thì chúng ta có thể kết luận mô hình lựa chọn là phù hợp để dự
báo trong các điều kiện khác của thí nghiệm. Sự khác nhau giữa Adj R2 và Pred R2 là 0,112 vậy mô hình lựa chọn là phù hợp để dự báo các điều kiện khác của thí nghiệm.
Hình 4.3. Tương tác giữa độẩm với nhiệt độ tới khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Từ hình trên cho thấy, lượng hoạt chất sinh ra tăng dần từ nhiệt độ250C
đến một giới hạn nhất định (32,20C).Sau đó hoạt chất sinh ra giảm dần trong khoảng nhiệt độ 32,20C đến 350C. Điều này có thể lý giải do nhiệt độ tăng làm các tếbào nấm mốc phát triển mạnh tạo điều kiện thuận lợi hoạt tính sinh
ra cao.Nhưng khi vượt mức nhiệt độ tối ưu thì quá trình chuyển hóa tạo thành và giải phóng các sản phẩm cuối cùng (hoạt chất AGIs) bịảnh hưởng.
Vì vậy, với mức nhiệt độ 32,2oC thì hoạt tính thu được đạt giá trị tối
ưu.Đây là mức nhiệt độđược coi là tối ưu cho quá trình này.
Hình 4.4. Tương tác giữa thời gian và độ ẩm tới khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Từ hình trên cho thấy, lượng hoạt chất sinh ra tăng dần khi độẩm ở 50 %
đến một giới hạn nhất định (56,6%). Sau đó hoạt chất sinh ra giảm dần trong khoảng 56,6% đến 60%. Điều này có thể lý giải do độẩm quá cao, làm cho các tế
bào nấm mốc khó sinh trưởng và ảnh hưởng đến quá trình sinh hoạt chất AGIs.
Vì vậy, với mức độ ẩm 56,6% thì hoạt tính thu được đạt giá trị tối
Hình 4.5.Tương tác giữa thời gian và nhiệt độ tới khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Từ hình cho thấy khi tăng thời gian lên men lượng hoạt chất thu được tăng. Tuy nhiên khi thời gian lên men đạt 59,68 giờ thì việc tăng thời gian không làm tăng hoạt chất. Mà kéo dài của thời gian sẽ kéo theo sự giảm khả
năng sinh hoạt chất. Vì lúc nào nguồn dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt dẫn tới các tế bào có số lượng giảm xuống, đồng thời hoạt chất AGIs giảm.
Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa khả năng sinh hoạt chất AGIs trên môi trường đậu đen xanh lòng bằng phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design Expert. Kết quả ta tìm được phương án tốt nhất để cực đại hàm mục tiêu là 87,8442 tại độ ẩm 56,6%, nhiệt độ 32,20C, thời gian 59,68 giờ.Kết quả được trình bày ở hình
Hình 4.6. Hàm kì vọng và điều kiện tối ưu khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Phần 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1.Kết luận
Trong thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã thực hiện đầy đủ các thì nghiệm và khảo sát được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6 như sau:
- Môi trường pH = 5,5 thì hoạt chất AGIs sinh ra là cao nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Môi trường lên men có độ ẩm 55% thì hoạt chất AGIs sinh ra là cao nhất.
- Môi trường lên men có nhiệt độ 300C thì hoạt chất AGIs sinh ra là cao nhất.
- Hoạt chất AGIs sinh ra cao nhất khi độ dày của môi trường là 25cm. - Tỷ lệ nguyên liệu được bổ sung vào môi trường 10% cám gạo, sẽ sinh
hoạt chất AGIs sinh ra là cao nhất.
- Tỷ lệ bổ sung lượng mốc 106 cfu/g vào môi trường lên men, cho hoạt