tiến[22]
Hoạt tính AGIs được xác định bằng đo sự hình thành 4 - nitrophenol bởi α-glucosidase ở bước sóng 405nm sau khi phản ứng với 4-nitrophenyl α - D-glucopyranoside (4-PNP). Điều kiện phản ứng với nồng độ cơ chất 1mg/ml, thời gian phản ứng là 30 phút và lượng α - glucosidase là 50µl
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase:
A đối chứng: độ hấp thụ của mẫu có 4 - PNP và α-glucosidase
A mẫu: độ hấp thụ của mẫu có 4 - PNP, α-glucosidase và mẫu thí nghiệm
Tiến hành
- Chuẩn bị α-glucosidase từ Rat intestinal aceton powder: Hòa 25mg Rat intestinal aceton powder vào 1 ml dung dịch 0,9% NaCl, nghiền đồng thể
bằng máy đánh siêu âm 30 giây 12 lần trong bể đá. Ly tâm 10000 v/p trong 30 phút, loại bỏ cặn, dịch nổi được sử dụng trực tiếp cho thí nghiệm ức chế.
- Xác định A đối chứng: Lấy 50 µl α-glucosidase(nồng độ 25mg/ml) vào trong ống nghiệm sạch (có đậy nắp), bổ sung 50 µl ρ-nitrophenyl α - D- glucopyranoside (nồng độ 0,9133 mg/ml) và 120 µl đệm phosphate 0,5M pH 6,7, lắc đều bằng máy vortex, giữ phản ứng ở 370C tại bể ổn nhiệt trong 60 phút, sau đó lấy ra dừng phản ứng bằng 50 µl 0,67M Na2CO3 rồi đo OD ở
bước sóng 405nm
- Xác định Amẫu: Lấy 150 µl dịch chiết mẫu + 50 µl α - glucosidase (nồng độ 25mg/ml) vào trong ống nghiệm sạch có đậy nắp, bổ sung 50 µl ρ- nitrophenyl α-D-glucopyranoside (nồng độ 0,9133 mg/ml) và 120 µl đệm phosphate 0,5M pH 6,7 lắc đều bằng máy vortex giữ phản ứng ở 370C tại bể ổn nhiệt trong 60 phút, sau đó lấy ra dừng phản ứng bằng 50 µl 0,67M Na2CO3 rồi đo OD ở bước sóng 405nm.
3.5.1.2. Phương pháp xác định độẩm
Nguyên tắc (Tiến hành theo TCVN 4326- 86): Xác định hàm lượng nước mất đi khi sấy mẫu ở nhiệt độ 100 - 1050C đến trọng lượng không đổi. Sai số cho phép giữa hai lần cân lặp lại trên cùng một mẫu thử không quá 0,2% trị số trung bình.
Sấy chén khô ở 1000C, để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng chén (G0). Lấy khoảng 3 - 5g mẫu, cho vào chén cân đã sấy khô, cân trọng lượng chén với mẫu trước khi cho vào sấy. Cho chén với mẫu vào tủ sấy, sấy
ở 100 - 1050C trong khoảng 6 - 8h, để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ
phòng, cân đến trọng lượng mẫu không đổi chén mẫu.
Công thức tính: Độẩm (W%) được tính theo công thức sau:
W (%) = [(G1 - G2)/(G1 - G0)]×100
Trong đó: G1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g) G2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g)
G0: Khối lượng chén sứ (g)
3.5.2.Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.5.2.1. Nghiên cứu quy trình lên men sinh hoạt chất AGIs bởi chủng A.oryzae T6
Sử dụng các môi trường lên men sau: Đậu đen xanh lòng làm môi trường lên men chủng A.oryzae T6 (mỗi lần thí nghiệm sử dụng 40g đậu đen xanh lòng).
a.Xác định pH môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành thí nghiệm lên men ở các pH môi trường khác nhau như: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5. Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần.Sau 48 giờ lên men đem xác định khả năngAGIs.
Cốđịnh các điều kiện: Nhiệt độ 280C
Độẩm 50%
Độ dày môi trường 25cm Bổ sung 5% cám gạo
Lượng giống bổ sung 106 cfu/g
b.Xác định độ ẩm môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành khảo sát môi trường lên men A.oryzae T6 tại các độ ẩm 45; 50; 55; 60 và 65%. Sau 48 giờ lên men đem xác định khả năngAGIs.Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cốđịnh các điều kiện: Nhiệt độ 280C pH (3.5.2.1a)
Độ dày môi trường 25cm Bổ sung 5% cám gạo
Lượng giống bổ sung 106 cfu/g
c.Xác định nhiệt độ môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành khảo sát nhiệt độ lên men A.oryzae T6 ở các khoảng nhiệt
độ: 25oC, 30oC, 35oC, 40oC. Sau 48 giờ lên men đem xác định khả năng AGIs.Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần.
Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a)
Độẩm (3.5.2.1b)
Độ dày môi trường 25cm Bổ sung 5% cám gạo
Lượng giống bổ sung 106 cfu/g
d.Xác định độ thoáng khí môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành khảo sát độ dày môi trường lên men A.oryzae T6 ở các độ
dầy môi trường:10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40cm. Sau 48 giờ lên men đem xác
Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a)
Độẩm (3.5.2.1b) Nhiệt độ (3.5.2.1c) Bổ sung 5% cám gạo
Lượng giống bổ sung 106 cfu/g
e.Xác định lượng giống mốc ban đầu bổ sung đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành khảo sát lượng giống nấm mốc ban đầu bổ sung vào môi trường lên men A.oryzae T6 ở các mốc: 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108 và 109. Sau 48 giờ lên men đem xác định hoạt tính AGIs và khả năng sinh trưởng của chủng A.oryzae T6.Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần. Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a) Độẩm (3.5.2.1b) Nhiệt độ (3.5.2.1c) Độ dày (3.5.2.1d) Bổ sung 5% cám gạo
f.Xác định tỷ lệ nguyên liệu môi trường lên men đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành thí nghiệm bổ sung cám gạo vào môi trường đậu đen xanh lòng để tiến hành lên men theo các tỷ lệ khác nhau: 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%. Sau 48 giờ kiểm tra khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs.Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần.
Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a) Độẩm (3.5.2.1b) Nhiệt độ (3.5.2.1c) Độ dày (3.5.2.1d) Lượng mốc (3.5.2.1e)
g.Xác định thời gian lên men cho sinh hoạt chất AGIscủa chủng A.oryzae T6
Tiến hành kiểm tra khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs của nấm mốc trong những khoảng thời gian khác nhau: 24; 26; 28; 30; 32; 34; 36; 38; 40; 42; 44; 46; 48; 50; 52; 54; 56; 58; 60 và 62 giờ. Kết quả nghiên cứu là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a) Độẩm (3.5.2.1b) Nhiệt độ (3.5.2.1c) Độ dày (3.5.2.1d) Lượng mốc (3.5.2.1e) Tỷ lệ nguyên liệu 10%