3.4.1.7. Xác định thời gian lên men cho sinh hoạt chất AGIscủa chủng A.oryzae T6
3.4.2. Sử dụng phần mềm tối ưu Desgin Expert lập ma trận và tiến hành tối ưu điều kiện lên men ưu điều kiện lên men
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp vi sinh
3.5.1.1. Xác định hoạt tính AGIs theo phương pháp của Yamaki và Mori cải tiến[22] tiến[22]
Hoạt tính AGIs được xác định bằng đo sự hình thành 4 - nitrophenol bởi α-glucosidase ở bước sóng 405nm sau khi phản ứng với 4-nitrophenyl α - D-glucopyranoside (4-PNP). Điều kiện phản ứng với nồng độ cơ chất 1mg/ml, thời gian phản ứng là 30 phút và lượng α - glucosidase là 50µl
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase:
A đối chứng: độ hấp thụ của mẫu có 4 - PNP và α-glucosidase
A mẫu: độ hấp thụ của mẫu có 4 - PNP, α-glucosidase và mẫu thí nghiệm
Tiến hành
- Chuẩn bị α-glucosidase từ Rat intestinal aceton powder: Hòa 25mg Rat intestinal aceton powder vào 1 ml dung dịch 0,9% NaCl, nghiền đồng thể
bằng máy đánh siêu âm 30 giây 12 lần trong bể đá. Ly tâm 10000 v/p trong 30 phút, loại bỏ cặn, dịch nổi được sử dụng trực tiếp cho thí nghiệm ức chế.
- Xác định A đối chứng: Lấy 50 µl α-glucosidase(nồng độ 25mg/ml) vào trong ống nghiệm sạch (có đậy nắp), bổ sung 50 µl ρ-nitrophenyl α - D- glucopyranoside (nồng độ 0,9133 mg/ml) và 120 µl đệm phosphate 0,5M pH 6,7, lắc đều bằng máy vortex, giữ phản ứng ở 370C tại bể ổn nhiệt trong 60 phút, sau đó lấy ra dừng phản ứng bằng 50 µl 0,67M Na2CO3 rồi đo OD ở
bước sóng 405nm
- Xác định Amẫu: Lấy 150 µl dịch chiết mẫu + 50 µl α - glucosidase (nồng độ 25mg/ml) vào trong ống nghiệm sạch có đậy nắp, bổ sung 50 µl ρ- nitrophenyl α-D-glucopyranoside (nồng độ 0,9133 mg/ml) và 120 µl đệm phosphate 0,5M pH 6,7 lắc đều bằng máy vortex giữ phản ứng ở 370C tại bể ổn nhiệt trong 60 phút, sau đó lấy ra dừng phản ứng bằng 50 µl 0,67M Na2CO3 rồi đo OD ở bước sóng 405nm.
3.5.1.2. Phương pháp xác định độẩm
Nguyên tắc (Tiến hành theo TCVN 4326- 86): Xác định hàm lượng nước mất đi khi sấy mẫu ở nhiệt độ 100 - 1050C đến trọng lượng không đổi. Sai số cho phép giữa hai lần cân lặp lại trên cùng một mẫu thử không quá 0,2% trị số trung bình.
Sấy chén khô ở 1000C, để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng chén (G0). Lấy khoảng 3 - 5g mẫu, cho vào chén cân đã sấy khô, cân trọng lượng chén với mẫu trước khi cho vào sấy. Cho chén với mẫu vào tủ sấy, sấy
ở 100 - 1050C trong khoảng 6 - 8h, để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ
phòng, cân đến trọng lượng mẫu không đổi chén mẫu.
Công thức tính: Độẩm (W%) được tính theo công thức sau:
W (%) = [(G1 - G2)/(G1 - G0)]×100
Trong đó: G1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g) G2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g)
G0: Khối lượng chén sứ (g)
3.5.2.Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.5.2.1. Nghiên cứu quy trình lên men sinh hoạt chất AGIs bởi chủng A.oryzae T6
Sử dụng các môi trường lên men sau: Đậu đen xanh lòng làm môi trường lên men chủng A.oryzae T6 (mỗi lần thí nghiệm sử dụng 40g đậu đen xanh lòng).
a.Xác định pH môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành thí nghiệm lên men ở các pH môi trường khác nhau như: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5. Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần.Sau 48 giờ lên men đem xác định khả năngAGIs.
Cốđịnh các điều kiện: Nhiệt độ 280C
Độẩm 50% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Độ dày môi trường 25cm Bổ sung 5% cám gạo
Lượng giống bổ sung 106 cfu/g
b.Xác định độ ẩm môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành khảo sát môi trường lên men A.oryzae T6 tại các độ ẩm 45; 50; 55; 60 và 65%. Sau 48 giờ lên men đem xác định khả năngAGIs.Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần.
Cốđịnh các điều kiện: Nhiệt độ 280C pH (3.5.2.1a)
Độ dày môi trường 25cm Bổ sung 5% cám gạo
Lượng giống bổ sung 106 cfu/g
c.Xác định nhiệt độ môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành khảo sát nhiệt độ lên men A.oryzae T6 ở các khoảng nhiệt
độ: 25oC, 30oC, 35oC, 40oC. Sau 48 giờ lên men đem xác định khả năng AGIs.Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần.
Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a)
Độẩm (3.5.2.1b)
Độ dày môi trường 25cm Bổ sung 5% cám gạo
Lượng giống bổ sung 106 cfu/g
d.Xác định độ thoáng khí môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành khảo sát độ dày môi trường lên men A.oryzae T6 ở các độ
dầy môi trường:10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40cm. Sau 48 giờ lên men đem xác
Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a)
Độẩm (3.5.2.1b) Nhiệt độ (3.5.2.1c) Bổ sung 5% cám gạo
Lượng giống bổ sung 106 cfu/g
e.Xác định lượng giống mốc ban đầu bổ sung đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành khảo sát lượng giống nấm mốc ban đầu bổ sung vào môi trường lên men A.oryzae T6 ở các mốc: 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108 và 109. Sau 48 giờ lên men đem xác định hoạt tính AGIs và khả năng sinh trưởng của chủng A.oryzae T6.Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần. Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a) Độẩm (3.5.2.1b) Nhiệt độ (3.5.2.1c) Độ dày (3.5.2.1d) Bổ sung 5% cám gạo
f.Xác định tỷ lệ nguyên liệu môi trường lên men đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Tiến hành thí nghiệm bổ sung cám gạo vào môi trường đậu đen xanh lòng để tiến hành lên men theo các tỷ lệ khác nhau: 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%. Sau 48 giờ kiểm tra khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs.Mỗi công thức lặp lại lại 3 lần.
Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a) Độẩm (3.5.2.1b) Nhiệt độ (3.5.2.1c) Độ dày (3.5.2.1d) Lượng mốc (3.5.2.1e)
g.Xác định thời gian lên men cho sinh hoạt chất AGIscủa chủng A.oryzae T6
Tiến hành kiểm tra khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs của nấm mốc trong những khoảng thời gian khác nhau: 24; 26; 28; 30; 32; 34; 36; 38; 40; 42; 44; 46; 48; 50; 52; 54; 56; 58; 60 và 62 giờ. Kết quả nghiên cứu là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Cốđịnh các điều kiện: pH (3.5.2.1a) Độẩm (3.5.2.1b) Nhiệt độ (3.5.2.1c) Độ dày (3.5.2.1d) Lượng mốc (3.5.2.1e) Tỷ lệ nguyên liệu 10%
3.5.2.2. Tối ưu một số yếu tố công nghệ lên men bề mặt tạo chất kìm hãm α- glucosidase theo quy hoạch thực nghiệm glucosidase theo quy hoạch thực nghiệm
Mục đích của phương pháp này là tìm các giá trị của yếu tố ảnh hưởng
để tại đó hàm mục tiêu đạt giá trị cực đại.Phương pháp này cho phép dẫn các biến số đến vùng tối ưu khi các biến số này thay đổi cùng một lúc. Quá trình này gồm hai giai đoạn: 1) Thiết lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm mục tiêu và các yếu tố ảnh hưởng; 2) Trên cơ sở mô hình toán học thiết lập (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Có rất nhiều yếu tốảnh hưởng đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase như
nhiệt độ, pH, tỷ lệ nguyên liệu, nồng độ muối, độ thoáng khí, độ ẩm. Sau các thí nghiệm thăm dò chúng tôi chọn 3 yếu tốảnh hưởng nhiều nhất
Chúng tôi chọn ma trân BOX-Behnken để khảo sát vùng tối ưu. Trong ma trận này số thí nghiệm tiến hành là 15
3.5.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu được tính toán bằng chương trình Microsoft Excel, sử dụng phần mềm IRRISTAT
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu một số yếu tốảnh hưởng đến hình thành hoạt chất AGIs trong quá trình lên men trong quá trình lên men
4.1.1. Nghiên cứu xác định pH môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Để xác định pH môi trường lên men chúng tôi tiến hành thí nghiệm lên men ở các pH môi trường khác nhau như: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5. Đồng thời cố định điều kiện lên men. Kết quả nghiên cứu được thể
hiện qua bảng.
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
STT pH môi trường Hoạt tính AGIs (%)
1 3,5 33,230f 2 4,0 41,433e 3 4,5 65,630c 4 5,0 66,170b 5 5,5 68,270a 6 6,0 65,500c 7 6,5 58,000d 8 7,0 32,700g 9 7,5 22,370h
(Ghi chú:a,b,c,d,e,f,g thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở mức ý nghĩa α = 0,05)
Từ bảng 4.1 chúng ta thấy, khi lên men chủngA.oryzae T6 trên môi
trường giống đậu đen xanh lòng có bổ sung cám gạo ở các pH khác nhau có khả năng sinh tổng hợp hoạt tính AGIs là khác nhau. Khả năng AGIs dao
động trong khoảng 22,370 - 68,270%. Khi lên men A.oryzae T6 ở pH 5,5 thì khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AGIs đạt cao nhất (68,27%). Nguyên nhân giải thích do sự thay đổi pH môi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện ly của phân tử các chất dinh dưỡng, làm hạ thấp khả năng sử dụng của chủng. Từ đó
ảnh hưởng đến quá trình sinh hoạt chất AGIs. Vì vậy chúng tôi chọn pH môi trường là 5,5 cho quá trình lên men.
4.1.2. Nghiên cứu xác định độ ẩm môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6 AGIs của chủng A.oryzae T6
Độ ẩm có ảnh hưởng rất lớn tới sự phát triển và khả năng sinh hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase của nấm mốc nên việc lựa chon độ ẩm thích hợp cho quá trình lên men là hết sức cần thiết. Để xác định điều kiện này chúng tôi tiến hành thí nghiệm ở các độ ẩm khác nhau như: 45%, 50%, 55%, 60%, 65%. Đồng thời cốđịnh các điều kiện nuôi cấy như: Sử dụng môi truờng là đậu đen xanh lòng bổ sung 5% cám gạo, nhiệt độ 28oC, pH 5,5. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua bảng.
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của độẩm môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Stt Độẩm môi trường (%) Hoạt tính AGIs (%)
1 45 61,10e
2 50 68,13c
3 55 74,60a
4 60 70,23b
5 65 63,40d
( Ghi chú:a,b,c,d,e thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở mức ý nghĩa α = 0,05)
Từ bảng 4.2 chúng ta thấy độẩm ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng nấm mốc A.oryzaeT6.Ở độ ẩm 45% và 65% chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khác. Điều này giải thích do nước là môi trường hòa tan các chất dinh dưỡng trước khi hấp thụ vào tế bào, đảm bảo sự cân bằng áp xuất thẩm thấu trong tế
bào. Vì tế bào nấm mốc tách với môi trường của chúng bằng loại màng sinh chất có tính thẩm thấu chọn lọc cho nên vi sinh vật chịu ảnh hưởng của sự
biến đổi nồng độ thẩm thấu trong môi trường.Nếu thiếu nước (độ ẩm thấp) sẽ
xảy ra hiện tượng loại bỏ nước ra khỏi tế bào, trao đổi chất bị giảm. Còn độẩm cao sẽ xảy ra hiện tượng nước từ bên ngoài đi vào bên trong tế bào nếu không có sự khống chế hữu hiệu thì tế bào sẽ bị trương lên và vỡ ra.Tại độẩm 55% chủng
A.oryzae T6 sinh hoạt chất AGIs của nó cũng đạt giá trị lớn nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn môi trường có độẩm 55% cho quá trình lên men.
4.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6 hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới sự phát triển của nấm mốc, mỗi loài chỉ
hoạt động ở một giới hạn nhiệt độ thích hợp.Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp AGIs của chủng A.oryzae T6 ở các mức nhiệt độ : 25oC, 30oC, 35oC, 40oC. Kết quả thu
được thể hiện qua bảng như sau:
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Stt Nhiệt độ (0C) Hoạt tính AGIs (%)
1 25 70,6c
2 30 78,4a
3 35 78,1b
4 40 62,1d
(Ghi chú: a,b,c,d thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức
ở mức ý nghĩa α = 0,05)
Qua bảng 4.3, chúng ta thấy nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh hoạt chất của chủng A.oryzae T6. Khi nghiên cứu nhiệt độ từ 250C -300C thì hoạt tính AGIs tăng từ 70,6% đến 78,4%. Tuy nhiên, đến nhiệt độ 350C thì
khả năng sinh tổng hợp hoạt chất của nó giảm xuống còn 78,1%, khi tiếp tục tăng thì hoạt chất giảm xuống 62,1%. Nguyên nhân này giải thích là do nhiệt độ môi trường sống của nấm mốc A.oryzae là ưu ấm.
Khi nhiệt độ thấp A.oryzae phát triển chậm, thời gian nuôi cấy kéo dài. Khi nhiệt độ tăng cao màng sinh chất của nấm mốc bị tổn thương đến mức khó hồi phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng. Điều này chứng tỏ ở
300Clà nhiệt độ phù hợp cho nấm mốc phát triển và sinh hoạt chất AGIs.Kết quả này cũng phù hợp với Hiroyuki Fụita đã công bố.Vì vậy chúng tôi lựa chọn môi trường có nhiệt độ 300C cho lên men.
4.1.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí trong quá trình lên men đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6 sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
A.oryzae là loài hô hấp hiếu khí vì vậy việc cung cấp oxy đầy đủ trong quá trình sinh trưởng và phát triển là yêu cầu quan trọng và cần thiết. Lượng oxy cung cấp tỷ lệ với độ dầy của môi trường nhân giống. Vì vậy tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của độ dày môi trườngkhác nhau: 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40cm.
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của độ thoáng khí trong quá trình lên men
đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Stt Độ dày (cm) Hoạt tính AGIs (%) 1 5 62,50e 2 10 71,20d 3 15 75,40c 4 20 78,18a 5 25 78,18a 6 30 75,87b 7 35 59,43f 8 40 50,20g
(Ghi chú :a,b,c,d,e,f,g thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở
mức ý nghĩa α = 0,05)
Qua bảng 4.4 chúng ta thấy độ thoáng khí ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh hoạt chất của chủng A.oryzae T6. Khi nghiên cứu độ dày môi trường lên
men từ 5 - 25cm thì hoạt tính AGIs dao động từ 62,5 - 78,18% và ở độ dày 20cm và 25cm thì khả năng sinh hoạt chất của nó là lớn nhất (đạt78,18%). Tuy nhiên độ dày từ 30cm thì lượng hoạt chất sinh ra lại giảm xuống là 75,87%, ta tiếp tục tăng độ dày thì hoạt chất giảm xuống còn 50,2%. Lượng hoạt chất AGIs sinh ra khác nhau như vậy có thể giải thích vì A.oryzae hô hấp hiếu khí và phát triển trong điều kiện thoáng khí. Nếu bề mặt môi trường không đảm bảo sự thoáng khí, độ dày môi trường lớn sẽ dẫn đến thiếu sự lưu thông oxy và, nấm mốc phát triển cục bộ. Một lượng nhỏ khí carbon là cần thiết cho chủng này phát triển nhưng nếu nồng độ này quá cao lại kìm hãm sự (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phát triển của chúng. Từ đó chúng tôi lựa chọn độ dày lên men là 25cm vì ở đồ dày này vẫn đảm bảo độ thoáng khí và tiết kiệm diện tích lên men. Vì vậy chúng tôi chọn độ dày lên men là 25cm.
4.1.5. Ảnh hưởng lượng giống nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Lượng giống ban đầu có ảnh hưởng đến quá trình lên men của nấm mốc. Nếu lượng giống ban đầu quá ít sẽ kéo dài thời gian lên men và tạo cơ hội cho các vi sinh vật khác phát triển. Ngược lại nếu lượng giống ban đầu quá lớn sẽ làm tăng chi phí nhân giống ngoài ra còn làm thay
đổi tỷ lệ sản phẩm phụ tạo thành ảnh hưởng đến khả năng thu nhận hoạt chất. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát lượng mốc giống ban đầu cho quá trình lên men để đạt hiệu quả thu nhận hoạt AGIs cao nhất. Kết quả
Bảng 4.5 Ảnh hưởng lượng giống nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6
Stt Lượng giống nấm mốc ban
đầu cho lên men
Hoạt tính AGIs (%) 1 102 63,20g 2 103 64,78f 3 104 68,40e 4 105 76,17b 5 106 78,21a 6 107 78,08a 7 108 72,70c 8 109 71,83d
(Ghi chú:a,b,c,d,e,f thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở
mức ý nghĩa α = 0,05)
Từ bảng 4.5 chúng ta thấy, với lượng giống khác nhau thì khả năng