Để biểu hiện ra sản phẩm, vector pET28-iEIB được biến nạp vào chủng E.
coli BL21. Đây là chủng dùng cho biểu hiện các protein tái tổ hợp do có chứa enzyme T7 RNA polymerase cần cho hoạt động phiên mã gen dưới sự kiểm soát của promoter T7. Tôi tiến hành thí nghiệm biến nạp pET28-iEIB vào vi khuẩn E.
coli BL21, sau đó chọn lọc khuẩn lạc nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung chất cảm ứng IPTG, đồng thời tôi cũng tiến hành thí nghiệm trên với plasmid pET28a(+) và pR-iEIB để so sánh mức độ biểu hiện.
Hình 4.8. Biểu hiện sản xuất carotenoid trên dòng tế bào E.coli BL21
Ống 1: cặn khuẩn của tế bào E. coli BL 21 mang pET28
Ống 2 : cặn khuẩn của tế bào E. coli BL21 mang pET28-IEIB
Ống 3: đối chứng cặn tế bào E. coli BL21 mang pR-iEIB
Kết quả cho thấy, ống 1 không cho màu sắc của carotenoid bởi vì không chưá cụm gen iEIB. Ống 2 và ống 3 cho cặn có màu của caroten, trong đó ống 3 (tương ứng với vector pRSET-iEIB) cho mức độ biểu hiện mạnh hơn ống 2 (tương
ứng pET28-iEIB) dựa vào độ đậm của màu sắc. Điều này có thể lý giải là do vector pRSET là plasmid có số bản copy cao, còn pET28 có số bản copy thấp, nên pRSET sẽ có sự biểu hiện enzyme nhiều hơn so với pET28 nên sản phẩm cuối cùng có màu đậm hơn.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
- Đã thiết kế thành công vector pET-iEIB có kích thước 9220bp dựa trên vector pR-iEIB với vector biểu hiện là pET28
- Tổ hợp gen này đã được biểu hiện trong chủng vi khuẩn E.coli BL21 tạo sinh khối màu hồng đặc trưng của carotenoid
Đề nghị
- Tiếp tục nghiên cứu múc độ biểu hiện của của cụm gen iEIB trong các vector biểu hiện khác
- Tiếp tục gắn gen CrtY vào vector biểu hiện chứa cụm gen iEIB để tạo ra beta caroten.
- Nghiên cứu tiếp về sự biểu hiện các carotenoid khác: β-carotene, zeaxanthin,..
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu
1. Lu, S. and L. Li, Carotenoid metabolism: biosynthesis, regulation, and beyond. J Integr
Plant Biol, 2008. 50(7): p. 778-85.
2. Guerin, M., M.E. Huntley, and M. Olaizola, Haematococcus astaxanthin: applications for
human health and nutrition. Trends Biotechnol, 2003. 21(5): p. 210-6.
3. Fraser, P.D. and P.M. Bramley, The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids. Prog
Lipid Res, 2004. 43(3): p. 228-65.
4. Gerster, H., The potential role of lycopene for human health. J Am Coll Nutr, 1997. 16(2):
p. 109-26.
5. Sies, H. and W. Stahl, Lycopene: antioxidant and biological effects and its bioavailability
in the human. Proc Soc Exp Biol Med, 1998. 218(2): p. 121-4.
6. Misawa, N., S. Yamano, and H. Ikenaga, Production of beta-carotene in Zymomonas
mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Erwinia uredovora. Appl Environ Microbiol, 1991. 57(6): p. 1847-9.
7. Zagalsky, P.F., E.E. Eliopoulos, and J.B. Findlay, The architecture of invertebrate
carotenoproteins. Comp Biochem Physiol B, 1990. 97(1): p. 1-18.
8. Misawa, N., et al., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway
by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J Bacteriol, 1990.
172(12): p. 6704-12.
9. Das, A., et al., An update on microbial carotenoid production: application of recent
metabolic engineering tools. Appl Microbiol Biotechnol, 2007. 77(3): p. 505-12.
10. Vershinin, A., Biological functions of carotenoids--diversity and evolution. Biofactors,
1999. 10(2-3): p. 99-104.
11. Stahl, W. and H. Sies, Antioxidant activity of carotenoids. Mol Aspects Med, 2003. 24(6):
p. 345-51.
12. Paiva, S.A. and R.M. Russell, Beta-carotene and other carotenoids as antioxidants. J Am
Coll Nutr, 1999. 18(5): p. 426-33.
13. Britton, G., Structure and properties of carotenoids in relation to function. Faseb j, 1995.
9(15): p. 1551-8.
14. Lee, P.C. and C. Schmidt-Dannert, Metabolic engineering towards biotechnological
production of carotenoids in microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol, 2002. 60(1-2):
p. 1-11.
15. Rohdich, F., et al., Studies on the nonmevalonate terpene biosynthetic pathway: metabolic
16. Ha Thi Bich Ngoc, T.T.H.N., Nguyễn Văn Mùi, Điều tra hợp chất carotenoid trong một số
thực vật của Việt Nam. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,
2006. 23: p. 130-134.
17. Smith, T.A., Carotenoids and cancer: prevention and potential therapy. Br J Biomed Sci,
1998. 55(4): p. 268-75.
18. Ernst, H., Recent advances in industrial carotenoid synthesis*. Fine Chemicals Research,
GVF/B – B 9, BASF AG D-67056 Ludwigshafen,Germany, 2002. 74: p. 1369-1382.
19. Debjani Dutta, U.R.C.a.R.C., Structure, health benefits, antioxidant property and
processing and storage of carotenoids Department of Food Technology and Biochemical
Engineering, Jadavpur University, Kolkata-700032, India, 2005: p. 153-155. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
20. Vilchez, C., et al., Marine carotenoids: biological functions and commercial applications.
Mar Drugs, 2011. 9(3): p. 319-33.
21. Bertram, J.S., Carotenoids and gene regulation. Nutr Rev, 1999. 57(6): p. 182-91.
22. Heller, F.R., O. Descamps, and J.C. Hondekijn, LDL oxidation: therapeutic perspectives.
Atherosclerosis, 1998. 137 Suppl: p. S25-31.
23. Palozza, P., et al., The protective role of carotenoids against 7-keto-cholesterol formation
in solution. Mol Cell Biochem, 2008. 309(1-2): p. 61-8.
24. Hughes, D.A., Effects of carotenoids on human immune function. Proc Nutr Soc, 1999.
58(3): p. 713-8.
25. Yamano, S., et al., Metabolic engineering for production of beta-carotene and lycopene in
Saccharomyces cerevisiae. Biosci Biotechnol Biochem, 1994. 58(6): p. 1112-4.
26. Leenheer, H.J.N.a.P.D., Microbial sources of carotenoid pigments used in foods and feeds.
Journal of Applied Bacteriology, 2008. 70(3): p. 181-191.
27. Aoki, H., et al., Carotenoid pigments in GAC fruit (Momordica cochinchinensis SPRENG).
Biosci Biotechnol Biochem, 2002. 66(11): p. 2479-82.
28. Nguyễn Thị Lý, T.T.H.V., Tách tinh dầu và carotenoid từ lá trầu (Piper betle L.). Hội Nghị Khoa Học & Công Nghệ lần 9, Phân ban Công nghệ Hóa học, Trường Đại học Bách khoa - Tp.HCM, 2010.