Để gắn được gen vào vector biểu hiện phải tiến hành nhiều thao tác, trải qua nhiều bước khác nhau. Quy trình được thực hiện theo quy trình sau:
Biến nạp và chọn lọc trên môi trường kháng sinh Tách chiết Cắt RE Hình 3.3 Quy trình gắn nối gen Tế bào khả biến Gen iEIB silicol
Vector pR-iEIB Vector pET 28
Sản phẩm pET28-iEIB Khuẩn lạc plasmid Sản phẩm cắt Cắt với RE Thiết kế Gắn nối
3.6.1.1. Phản ứng cắt enzyme giới hạn để thôi gel
Cắt gen iEIB tách khỏi vector pR-iEIB và cắt mở vòng vector biểu hiện pET28 với enzyme XbaI và EcoRI
Bảng 3.3: Thành phần phản ứngcắt Hóa chất Thể tích (µl) DNA 10 Buffer tango 2X 6 Enzyme EcoRI 3 Enzym XbaI 3 H20 8 Tổng 30 - Tiến hành ủở 370 C trong 30 phút 3.6.1.2 . Phương pháp điện di
Các bước chuẩn bịđiện di:
Chuẩn bị gel
- 1g agarose cho vào 100 ml dịch TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng trong 2-3 phút cho tan hết
- Để gel nguội đến khoảng 500C, đổ bản gel đã cài lược sẵn để trong 30 phút cho gel đông lại
- Đặt bản gel vào bểđiện di, đổ dung dich TAE 1X vào bểđiện di sao cho vừa ngập bản gel, sau đó rút lược ra khỏi bản gel
Tra mẫu điện di
- Tra theo tỷ lệ 1:5 (1 µl loading dye: 5µl mẫu)
- Điện di ở hiệu điện thế 100V, 200mA, ở 35 phút thì dừng lại
Nhuộm gel
Bản gel lấy ra khỏi khay điện di và nhuộm ethidium bromide trong 15 phút Soi và chụp bản gel bằng máy chụp gel
Quy trình theo hướng dẫn của bộ kit “GeneJET Gel Extraction Kit”
Cắt gel: đưa bản điện di lên máy soi gel và cắt lấy band mong muốn, sau đó cho vào ống Effendorft 1,5 ml
+ Bổ sung đệm ly giải gel Bindding buffer vào ống Eppendorf theo tỷ lệ 1:1 (1g tương đương với 1000µl)
+ Ủở 55 0C trong 10 phút, cứ 2-3 phút đảo nhẹ 1 lần giúp gel nhanh tan
+ Hút dịch sang cột lọc, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1 phút , loại bỏ phần dịch lỏng
+ Bổ sung 700µl đệm rửa (washing buffer), ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch lỏng
+ Ly tâm lần 2 ở 10000 vòng/ phút trong 1 phút để loại bỏ hết ethanol thừa + Chuyển cột lọc sang ống effendorf mới, bổ sung 25µl đệm đẩy (Elution buffer), sau đó li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút
+ Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel
3.6.1.4. Phản ứng nối cụm gen iEIB vào vector pET28
Nối sản phẩm thôi gel bằng T4 DNA ligase
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối Hóa chất Thể tích (µl) Buffer 5X 2 Vector 4 DNA 12 T4 DNA ligase 1 Tổng 20 - Ủ 220 C trong 1 giờ
3.6.2. Biến nạp vector pET28-iEIB vào E.coli
3.6.2.1. Biến nạp
Hình 3.4. Sơ đồ biến nạp plasmid pET28-iEIB vào E. coli DH5α (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả biến của vi khuẩn E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt, cấy trải trên môi trường LB Kana rắn
Các bước tiến hành:
+ Lấy ống tế bào khả biến E. coli DH5α từ tủ -800 C và đặt ở trong đá lạnh 30 phút
+ Hút toàn bộ sản phẩm nối vào ống chứa tế bào khả biến, để trên đá lạnh 30 phút
+ Lấy ống tế bào khả biến trên ra khỏi đá và đặt bể ổn nhiệt 420C trong 90 giây, sau đó đưa nhanh tế bào vào trong đá 2 phút
+ Bổ sung 700µl môi trường LB lỏng vào ống tế bào biến nạp, nuôi phục hồi
ở 370C trong thời gian 30 phút
+ Sau khi nuôi phục hồi lấy toàn bộ tế bào biến nạp nuôi trên môi trường chọn lọc thạch LB kana, thao tác nhanh, trang đều trên mặt thạch đến khi khô mặt thạch.
+ Nuôi ở 370C, qua đêm
3.6.2.1. Phương pháp tách chiết Plasmid
Để phân tích kết quả gen iEIB từ pR-SETA chuyển sang vector pET28 : tôi tiến hành lấy khuẩn lạc riêng rẽ nuôi trên môi trường LB lỏng , có bổ sung kháng sinh Kanamycin, nuôi ở 370 C, lắc 150 vòng/ phút.
3.6.2.1.1. Tách plasmid bằng phương pháp ankaline lysis
+ Thu cặn tế bào, ly tâm 5000 vòng/ 1 phút trong 3 phút + Bổ sung 200µl solution I, vortex cho tan hết cặn + Bổ sung 400µl solution II, mix nhẹ 6-8 lần + Bổ sung thêm 350µl solution III, mix nhẹ 6-8 lần
+ Ly tâm 10000 v/p trong 10 phút, thu dịch lỏng sang ống effpendorf mới + Bổ sung 700µl CIAA mix 6-8 lần, ly tâm 10000 v/p trong 10 phút
+ Thu dịch pha trên, sau đó bổ sung thêm 50µl CH3COOK + 800µl isopropanol, mix nhẹ. Đem ly tâm 1000v/p trong 20 phút
+ Loại bỏ dịch nổi, thu cặn thêm 1000µl EtOH 70% lạnh. Sau đó, ly tâm 10000v/p trong 1 phút
+ Ly tâm lần 2 ở 10000v/p trong 1 phút để loại bỏ hết EtOH + Thu cặn, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-7 phút + Bổ sung 50µl TE + 2µl RNase, mix đều
+ Điện di sản phẩm tách chiết
3.6.2.1.2. Tách plasmid bằng Kit “Gene JET plasmid Miniprep “
+ Ly tâm thu cặn khuẩn, 5000 v/p trong 3 phút
+ Bổ sung 250 µl Resuspension buffer vào ống tế bào, vortex tan dịch khuẩn + Bổ sung 250 µl Lysis buffer, đảo nhẹ 4-6 lần
+ Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút, thu dịch nổi
+ Sau đó ly tâm 10000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi
+ Chuyển cột lọc sang ống effendoft rồi bổ sung 500 µl washing buffer, ly tâm 1 phút
+ Loại bỏ dịch nổi, ly tâm thêm 1 phút để loại bỏ dịch
+ Chuyển sang ống effendoft mới, thêm 50µl Elution buffer, đợi 2 phút sau
đó ly tâm 10000 v/p trong 1 phút, thu được plasmid
3.6.2.3. Thành phần phản ứng cắt kiểm tra chiều gắn nối bằng enzyme giới hạn
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt XhoI Thành phần Thể tích (µl) plasmid 5 buffer 1 Enzyme XhoI 1 H2 O 3 Tổng 10
3.6.2.4. Kiểm tra gen gắn nối bằng phương pháp PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhân gen EIB với cặp mồi tương ứng
Mồi F- crtE TGCCGTAAATGTATCCGTTT
Mồi R- crtB CTAGAGCGGGCGCTGCCA
Với chu trình nhiệt như sau: 950C trong 45 giây
950C trong 30 giây
610C trong 45 giây 35 chu kỳ
720C trong 3 phút 40 giây 720C trong 10 phút
Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) PCR master mix 7,5 Mồi R 1 Mồi F 1 DNA 2 H2O 3,5 Tổng 15
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả thiết kế vector tái tổ hợp mang cụm gen iEIB trên nền tảng pET28 4.1 .Kết quả sàng lọc dòng tái tổ hợp
Kết quả cắt thu cụm gen iEIB bằng phản ứng cắt bằng enxym giới hạn
Cụm gen iEIB bao gồm 4 gen Idi, Crt E, Crt I và Crt B, nằm trong vùng giới hạn của 2 enzym XbaI và EcoRI. Vì vậy, để phân tách cụm gen trên tôi tiến hành cắt bằng 2 enzym XbaI và EcoRI. Phản ứng cát thành công khi sản phẩm cắt tạo thành hai băng sáng có kích thước tương ứng là 3958bp và một băng có kích thước khoảng 2655bp. Kết quảđiện di thể hiện trên hình 4.1
Hình 4.1. Kết quả cắt thu cụm gen iEIB từ pR-iEIB
Đường chạy 1: sản phẩm cắt pR-iEIB Đường chạy 2: sản phẩm cắt pET28
Đường chạy M: thang DNA chuẩn của hãng Thermo Sientific
Kết quảđiện di cho thấy đã cắt thành công cụm gen iEIB có kích thước 3958 bp.
Sàng lọc các dòng tái tổ hợp
Cụm gen iEIB bao gồm các gen Idi, Crt E, Crt I, CrtB. Với mục tiêu kiểm tra năng lực biểu hiện đa gen giữa hệ vector pRSET-A và pET28, cụm gen này được
chuyển từ vector pRSET-A sang pET28. Quá trình thực nghiệm được tiến hành như đã mô tảở hình 3.2. Tám dòng E. coli nghi ngờ mang pET28 chứa cụm gen iEIB, kí hiệu là pET28-iEIB, được sàng lọc bằng phương pháp điện di so sánh kích thước trên gel agarose. Kết quảđược thể hiện trên hình 4.2
Hình 4.2: Kết quảđiện di kiểm tra các dòng plasmid
Đường chạy 1,2,3,4,5,6,7,8: các dòng plamid pET28 -iEIB
Đường chạy M: đối chứng- vector pET 28
Kết quả diện di cho thấy, trong 8 dòng khuẩn lạc thu được chỉ có 5 dòng : dòng 2, dòng 3, dòng 5, dòng 7 và dòng 8 là có kích thước lớn hơn so với vector pET28 gốc, đây có thể là các vector pET28 được gắn gene iEIB. Các băng mờ phía trên có thể là các dạng plasmid khác nhau trong tế bào E. coli DH5α. Dòng 2,3,5,7,8
được tôi sử dụng chọn để sàng lọc các bước tiếp theo
Kết quả chọn lọc dòng mang pET28-iEIB bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn
Cơ sở: Ở 2 đầu của cụm gene iEIB được thiết kế 2 enzyme giới hạn đó là
enzyme XbaI ( ở đầu gen Idi) và enzyme EcoRI ( ở cuối gen CrtB), 2 enzyme này
có vị trí duy nhất trên vector pET28-iEIB. Do vậy khi cắt đồng thời hai enzyme
XbaI và EcoRI trên vector pET28-iEIB sẽ taọ ra 2 đoạn: một đoạn có kích thước ≈ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3958bp ( tương ứng với cụm gen iEIB) và một đoạn có kích thước ≈5232 bp ( tương
ứng với vector pET28 mở vòng).
Hình 4.3: Kết quảđiện di sản phẩm cắt Hình 4.4. Sơđồ vector biểu hiện plasmid các dòng bằng XbaI và EcoRI
Đường chạy số 1,2,3,4,5 tương ứng các dòng 2,3,5,7,8
Đường L: thang DNA chuẩn của Thermo Sientific
Đường DC: vector pET28-iEIB cắt mở vòng kiểm tra kích thước
Kết quả trên cho thấy, sau khi cắt đã tạo ra được 2 băng: một băng với kích thước khoảng 5232 bp ( tương ứng kích thước vector pET28) và một băng kích thước tương ứng khoảng 3958bp ( tương ứng kích thước iEIB). Đây có thể là vector pET-iEIB theo lý thuyết
Kiểm tra chiều gắn gene iEIB trong pET-iEIB:
Cụm gen iEIB mã hoá các enzyme sinh tổng hợp lycopene, để có thể chuyển lycopene sang hợp chất beta caroten cần có sự tham gia của enzyme lycopene
cyclase được mã hóa bởi gen CrtY. Gen CrtY được thiết kế 2 đầu là 2 enzyme
EcoRI và HindIII. Do vậy, để có thể thực hiện gắn được gen này vào sau cụm gen iEIB thì vị trí EcoRI phải được bảo toàn và cụm gen iEIB được gắn xuôi chiều từ vị
trí enzyme XbaI→EcoRI (cùng chiều với promoter T7). Đây là lí do mà tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm đảm bảo cho thí nghiệm gắn gen CrtY về sau.
a
b
Hình 4.5. Minh họa 2 khả năng gắn nối của cụm gen iEIB trong pET28 a, trường hợp: gắn xuôi chiều b, trường hợp gắn ngược chiều
Cơ sở: Trên vector pET28-iEIB có 2 vị trí của enzyme XhoI, trong đó 1 vị
trí nằm trên cụm gen iEIB và 1 vị trí nằm trên vector pET28a (+). Khi cắt vector này bằng enzyme XhoI, sẽ có 2 trường hợp xảy ra:
- Trường hợp 1: cụm gen iEIB gắn cùng chiều: Sẽ tạo ra 2 băng có kích thước tương ứng ≈ 2481 bp và ≈ 6739 bp
- Trường hợp 2: cụm gen iEIB gắn ngược chiều: Sẽ tạo ra 2 băng có kích thước1524bp và một băng có kich thước là 7696bp
Kết quảđiện di hình 4.3 cho thấy iEIB đã gắn đúng chiều: Khi cắt các dòng thu được với enzyme XhoI thì xuất hiện hai băng với kích thước một băng là 6739bp và băng còn lại là 2481bp
Hình 4.6. Kết quả cắt pET-iEIB với XhoI
Đường chạy 1,2,3,4,5 tương ứng các dòng 2,3,5,7,8 cắt XhoI
Đường M : thang DNA chuẩn của hãng Thermo sientific Kiểm tra sự có mặt gen EIB bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu
Trong cấu trúc cụm gen chuyển bao gồm các gen Idi, CrtE, CrtI và CrtB là
những gen không thể thiếu trong quá trình tổng hợp carotenoid . Để kiểm tra sự có mặt của các gen trên tôi tiến hành nhân gen với cặp mồi ở 2 đầu của cụm gen iEIB tương ứng với mồi F của gen CrtE và mồi R của gen CrtB
1 2 3 M 4 5
6739bp
Hình 4.7. Kết quả sản phẩm chạy điện di PCR
Đường chạy 1,2,3,4,5 tương ứng các dòng mang gen iEIB
Đường chạy DC: đối chứng – sản phẩm cụm gen EIB được khuếch đại trước đó (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đường chạy M: thang DNA chuẩn của hãng Thermo sientific
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các gen ở đường chạy số 1,2,3,4,5 tương ứng với các dòng nghi ngờ đều xuất hiện các băng sáng rõ với kích thước
≈3397bp tương ứng với gene EIB. Như vậy gen EIB đã được khuếch đại đặc hiệu. Kết luận các dòng trên đều mang gen cần gắn nối
4.2. Kết quả biểu hiện pET28-iEIB trong E. coli BL21 (DE3)
Để biểu hiện ra sản phẩm, vector pET28-iEIB được biến nạp vào chủng E.
coli BL21. Đây là chủng dùng cho biểu hiện các protein tái tổ hợp do có chứa enzyme T7 RNA polymerase cần cho hoạt động phiên mã gen dưới sự kiểm soát của promoter T7. Tôi tiến hành thí nghiệm biến nạp pET28-iEIB vào vi khuẩn E.
coli BL21, sau đó chọn lọc khuẩn lạc nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung chất cảm ứng IPTG, đồng thời tôi cũng tiến hành thí nghiệm trên với plasmid pET28a(+) và pR-iEIB để so sánh mức độ biểu hiện.
Hình 4.8. Biểu hiện sản xuất carotenoid trên dòng tế bào E.coli BL21
Ống 1: cặn khuẩn của tế bào E. coli BL 21 mang pET28
Ống 2 : cặn khuẩn của tế bào E. coli BL21 mang pET28-IEIB
Ống 3: đối chứng cặn tế bào E. coli BL21 mang pR-iEIB
Kết quả cho thấy, ống 1 không cho màu sắc của carotenoid bởi vì không chưá cụm gen iEIB. Ống 2 và ống 3 cho cặn có màu của caroten, trong đó ống 3 (tương ứng với vector pRSET-iEIB) cho mức độ biểu hiện mạnh hơn ống 2 (tương
ứng pET28-iEIB) dựa vào độ đậm của màu sắc. Điều này có thể lý giải là do vector pRSET là plasmid có số bản copy cao, còn pET28 có số bản copy thấp, nên pRSET sẽ có sự biểu hiện enzyme nhiều hơn so với pET28 nên sản phẩm cuối cùng có màu đậm hơn.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
- Đã thiết kế thành công vector pET-iEIB có kích thước 9220bp dựa trên vector pR-iEIB với vector biểu hiện là pET28
- Tổ hợp gen này đã được biểu hiện trong chủng vi khuẩn E.coli BL21 tạo sinh khối màu hồng đặc trưng của carotenoid
Đề nghị
- Tiếp tục nghiên cứu múc độ biểu hiện của của cụm gen iEIB trong các vector biểu hiện khác
- Tiếp tục gắn gen CrtY vào vector biểu hiện chứa cụm gen iEIB để tạo ra beta caroten.
- Nghiên cứu tiếp về sự biểu hiện các carotenoid khác: β-carotene, zeaxanthin,..
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu
1. Lu, S. and L. Li, Carotenoid metabolism: biosynthesis, regulation, and beyond. J Integr
Plant Biol, 2008. 50(7): p. 778-85.
2. Guerin, M., M.E. Huntley, and M. Olaizola, Haematococcus astaxanthin: applications for
human health and nutrition. Trends Biotechnol, 2003. 21(5): p. 210-6.
3. Fraser, P.D. and P.M. Bramley, The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids. Prog
Lipid Res, 2004. 43(3): p. 228-65.
4. Gerster, H., The potential role of lycopene for human health. J Am Coll Nutr, 1997. 16(2): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
p. 109-26.
5. Sies, H. and W. Stahl, Lycopene: antioxidant and biological effects and its bioavailability
in the human. Proc Soc Exp Biol Med, 1998. 218(2): p. 121-4.
6. Misawa, N., S. Yamano, and H. Ikenaga, Production of beta-carotene in Zymomonas
mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from
Erwinia uredovora. Appl Environ Microbiol, 1991. 57(6): p. 1847-9.
7. Zagalsky, P.F., E.E. Eliopoulos, and J.B. Findlay, The architecture of invertebrate
carotenoproteins. Comp Biochem Physiol B, 1990. 97(1): p. 1-18.
8. Misawa, N., et al., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway
by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J Bacteriol, 1990.
172(12): p. 6704-12.
9. Das, A., et al., An update on microbial carotenoid production: application of recent
metabolic engineering tools. Appl Microbiol Biotechnol, 2007. 77(3): p. 505-12.
10. Vershinin, A., Biological functions of carotenoids--diversity and evolution. Biofactors,
1999. 10(2-3): p. 99-104.
11. Stahl, W. and H. Sies, Antioxidant activity of carotenoids. Mol Aspects Med, 2003. 24(6):
p. 345-51.
12. Paiva, S.A. and R.M. Russell, Beta-carotene and other carotenoids as antioxidants. J Am
Coll Nutr, 1999. 18(5): p. 426-33.
13. Britton, G., Structure and properties of carotenoids in relation to function. Faseb j, 1995.
9(15): p. 1551-8.
14. Lee, P.C. and C. Schmidt-Dannert, Metabolic engineering towards biotechnological