Ở Việt Nam các nghiên cứu về carotenoid cũng đã được tiến hành. Hà Thị
Bích Ngọc và các cộng sự tại Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-
Đại học Quốc gia Hà Nội đã tiến hành phân tích và khảo sát hàm lượng carotenoid trong các bộ phận lá, hoa, củđối với 30 loài thực vật ở Việt Nam bằng phương pháp HPLC. Kết quả cho thấy, trong các mẫu khảo sát hàm lượng β- caroten có nhiều nhất ở lá đu đủ (57,059%); hàm lượng lutein có nhiều nhất ở lá đinh lăng (50,762%), hàm lượng lycopen có nhiều nhất ở quả cà chua (22,483%) [16]
Trong một nghiên cứu khác, khi phân tích các carotenoid ở thịt quả và màng hạt trong trái Gấc Việt Nam cũng bằng phương pháp HPLC, các tác giả đã chỉ ra trong trái Gấc chứa một lượng carotenoid khá lớn, nhất là ở màng hạt Gấc. Trong một gam thịt quả gấc (phần có màu vàng) chứa 7-37 µg β-carotene, 0,2-1,6 µg lycopene, còn trong một gam màng hạt gấc chứa 310-460 µg lycopene, 60-140 µg
β-carotene. Các tác giả cũng cho rằng nồng độ lycopene trong màng hạt gấc gấp từ
4-10 lần so với lượng lycopene trong một số rau quảđược cho là giàu lycopene[27] Tại Hội nghị Khoa học và Công nghệ lần thứ 9, hai tác giả Nguyễn Thị Lý và Trần Thị Hồng Vân đã trình bày báo cáo phương pháp và kết quả nghiên cứu tách chiết tinh dầu và carotenoid từ lá Trầu Không (Piper betle L.). Kết quả nghiên cứu của họ cho thấy, tỷ lệ tinh dầu tách chiết được từ lá Trầu Không là 0,9-1% và hàm lượng carotenoid đạt 0,19%. Sản phẩm này khá tinh khiết, quang phổ IR không phức tạp, đồng dạng với phổ IR của β-caroten [28]
Trong nội dung của “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng
điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020” của chính phủ số
61/2007/QD-TTg năm 2007, đã đưa ra nội dung của chương trình nghiên cứu các hoạt chất thiên nhiên để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, trong đó có các nội dung:
- Tổ chức nhân giống và trồng đại trà cây gấc và cây hoa cúc giống tốt, có hàm lượng carotenoid cao ở huyện Lương Sơn, tỉnh Hòa Bình;
- Sản xuất các hoạt chất carotenoid, nguyên liệu để bào chế thuốc viga, vicuva, vicuga;
- Nghiên cứu tách chiết lutein, zeaxanthin từ hoa cúc vạn thọ để làm nguyên liệu bào chế thuốc vicuva”.
Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về sản xuất carotenoid trên vi sinh vật hay điều hướng trao đổi chất sản xuất carotenoid được công bố. Chính vì thế, việc nghiên cứu thiết kế các vector biểu hiện gene tổng hợp carotenoid là cơ sở cho việc sản xuất carotenoid năng suất cao ở Việt Nam
PHẦN 3.
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Vector pR-iEIB do Bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ gen , Viện Khoa học Sự sống cung cấp
- Vector pET28a (+) mua của hãng NovagenTM
- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α do Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học- Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Chủng vi khuẩn E. coli BL 21 do Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Công Nghệ Sinh Học- Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
3.2. Hóa chất
3.2.1. Hóa chất cho quá trình biến nạp
- Hóa chất cho khả nạp: CaCl2 0.1 M, glycerol 15% - Hóa chất biến nạp: amp , IPTG, X-gal
3.2.2. Hóa chất dung cho gắn nối gene vào vector
- Enzyme T4 DNA ligase của hãng InvitrogenTM - Vector pET28a (+) mua của hãng NovagenTM
Hình 3.1: Cấu trúc vector biểu hiện pET28 Thành phần cấu tạo từng phần trong plasmid Bảng 3.1. Thành phần cấu trúc vector pET28 Thành phần Vai trò Vị trí T7 promoter Kiểm soát chặt chẽ sự biểu hiện của gene Base 368-386
Vùng khởi đầu sao chép Cho phép tạo ra số lương lớn trong
E. coli
Base 3270-3889
Vị trí đa tách dòng Cho phép gắn gene quan tâm Base 158-204
Xpress fwd primer Base 222-240
ORF frame 1 Vị trí khung đọc 1 Base 523-1023 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ORF frame 2 Vị trí khung đọc 2 Base 3995- 4810
Ngoài ra, vector pET 28 có chứa gene kháng kanamycin. Nhờ đó mà vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa kanamycin, giúp chọn lọc các dòng mong muốn
3.2.3. Hóa chất dùng cho thí nghiệm biến nạp và nuôi khuẩn
- Môi trường nuôi cấy E. coli :
+ Môi trường LB lỏng : 1% tripton
0,5% dịch chiết nấm men 1% NaCl
+ Môi trường LB rắn: 1% tripton
0,5 % dịch chiết nấm men 1% NaCl
1,5 % agarose - Kháng sinh Kanamycin: 100mg/ml
3.2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt enzyme giới hạn
- Enzyme giới hạn : XbaI, E.coRI, … của hãng Thermo Scientific
- Enzyme nối T4 DNA ligase và buffer T4 được cung cấp từ hãng Thermo Scientific
3.2.5. Hóa chất dùng cho tách chiết DNA plasmid
- Phương pháp tách chiết bằng Kit: sử dụng bộ Kit “ GenJET plasmid Miniprep Kit” của hãng Thermo Scientific
- Tách chiết plasmid theo phương pháp “ Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS” ( Molecular Cloning A Laboratory Manual On The Web Maniatis ( Edicion Para Impimir )): gồm các dung dịch 1,2 và 3
Sol I: Glucose : 50mM Tris-HCl pH 8,0 : 25 mM EDTA pH 8,0 : 10mM Sol II SDS : 1% NaOH : 0,2 N
Sol III:
Kali Acetate : 3 M
Acid Glacial Acetic : 5M
TE:
Tris-HCl pH 8,0 : 10mM
EDTA : 1mM
3.1.2.6. Hóa chất dùng cho phản ứng thôi gel
Bộ Kit chiết DNA từ gel : GeneJET Gel Extraction Kit của Thermo Scientific
3.3. Thiết bị
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
Máy lắc SK3000- Jeotech- Korea
Máy PCR Amplied Biosystems USA/ Singapo
Bộđiện di Scie- plas Ltd- UK (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lò vi sóng F- 51BW-Horiba- Janpan
Máy đo pH MS- 2347 AR-LG VN
Tủ lạnh -200C,-800 C Super freezer Eco 130- Ficchetti- Italy
Máy chụp ảnh gel Gel Logic 1500-Kodak- USA
Cân điện tử TE 214S- Startorius Germany
Bểổn nhiệt Techne- OSI
Máy khử ion Casada Bio Water system - Pall Co-UK
Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu- 425- 400E- Nuarie -USA
Máy Vortex Vortex Genius 3- IKA Genmany/China
Máy Spindown E- centrifuge- Wealtec- Taiwan/USA
Máy li tâm Eppendorf – CHLB Đức
Pipeete 8 - channel Thermo Labsystem- Germany
Nồi hấp khử trùng HV-110-Hirayma- Japan
Bể rửa song siêu âm Jeiotech - Korea
3.4. Địa điểm và thời gian thực tập
- Địa điểm: Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gene, Viện Khoa học Sự
- Thời gian: Từ tháng 3 đến tháng 6/2014
3.5. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Thiết kế vector biểu hiện pET28-iEIB
Hình 3.2. Sơđồ thiết kế vector pET28-iEIB
Cắt với XbaI và EcoRI
Cắt với XbaI và EcoRI
• Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E. coli DH5α khả biến
• Chọn lọc các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp
• Tách chiết plasmid
• Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn, PCR để kiểm tra
- Nội dung 2: Biểu hiện pET28-iEIB trong E.coli BL21
3.6. Phương pháp nghiên cứu
3.6.1. Quy trình gắn nối cụm gen iEIB vào vector pET 28
Để gắn được gen vào vector biểu hiện phải tiến hành nhiều thao tác, trải qua nhiều bước khác nhau. Quy trình được thực hiện theo quy trình sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Biến nạp và chọn lọc trên môi trường kháng sinh Tách chiết Cắt RE Hình 3.3 Quy trình gắn nối gen Tế bào khả biến Gen iEIB silicol
Vector pR-iEIB Vector pET 28
Sản phẩm pET28-iEIB Khuẩn lạc plasmid Sản phẩm cắt Cắt với RE Thiết kế Gắn nối
3.6.1.1. Phản ứng cắt enzyme giới hạn để thôi gel
Cắt gen iEIB tách khỏi vector pR-iEIB và cắt mở vòng vector biểu hiện pET28 với enzyme XbaI và EcoRI
Bảng 3.3: Thành phần phản ứngcắt Hóa chất Thể tích (µl) DNA 10 Buffer tango 2X 6 Enzyme EcoRI 3 Enzym XbaI 3 H20 8 Tổng 30 - Tiến hành ủở 370 C trong 30 phút 3.6.1.2 . Phương pháp điện di
Các bước chuẩn bịđiện di:
Chuẩn bị gel
- 1g agarose cho vào 100 ml dịch TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng trong 2-3 phút cho tan hết
- Để gel nguội đến khoảng 500C, đổ bản gel đã cài lược sẵn để trong 30 phút cho gel đông lại
- Đặt bản gel vào bểđiện di, đổ dung dich TAE 1X vào bểđiện di sao cho vừa ngập bản gel, sau đó rút lược ra khỏi bản gel
Tra mẫu điện di
- Tra theo tỷ lệ 1:5 (1 µl loading dye: 5µl mẫu)
- Điện di ở hiệu điện thế 100V, 200mA, ở 35 phút thì dừng lại
Nhuộm gel
Bản gel lấy ra khỏi khay điện di và nhuộm ethidium bromide trong 15 phút Soi và chụp bản gel bằng máy chụp gel
Quy trình theo hướng dẫn của bộ kit “GeneJET Gel Extraction Kit”
Cắt gel: đưa bản điện di lên máy soi gel và cắt lấy band mong muốn, sau đó cho vào ống Effendorft 1,5 ml
+ Bổ sung đệm ly giải gel Bindding buffer vào ống Eppendorf theo tỷ lệ 1:1 (1g tương đương với 1000µl)
+ Ủở 55 0C trong 10 phút, cứ 2-3 phút đảo nhẹ 1 lần giúp gel nhanh tan
+ Hút dịch sang cột lọc, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1 phút , loại bỏ phần dịch lỏng
+ Bổ sung 700µl đệm rửa (washing buffer), ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch lỏng
+ Ly tâm lần 2 ở 10000 vòng/ phút trong 1 phút để loại bỏ hết ethanol thừa + Chuyển cột lọc sang ống effendorf mới, bổ sung 25µl đệm đẩy (Elution buffer), sau đó li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút
+ Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel
3.6.1.4. Phản ứng nối cụm gen iEIB vào vector pET28
Nối sản phẩm thôi gel bằng T4 DNA ligase
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối Hóa chất Thể tích (µl) Buffer 5X 2 Vector 4 DNA 12 T4 DNA ligase 1 Tổng 20 - Ủ 220 C trong 1 giờ
3.6.2. Biến nạp vector pET28-iEIB vào E.coli
3.6.2.1. Biến nạp
Hình 3.4. Sơ đồ biến nạp plasmid pET28-iEIB vào E. coli DH5α (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả biến của vi khuẩn E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt, cấy trải trên môi trường LB Kana rắn
Các bước tiến hành:
+ Lấy ống tế bào khả biến E. coli DH5α từ tủ -800 C và đặt ở trong đá lạnh 30 phút
+ Hút toàn bộ sản phẩm nối vào ống chứa tế bào khả biến, để trên đá lạnh 30 phút
+ Lấy ống tế bào khả biến trên ra khỏi đá và đặt bể ổn nhiệt 420C trong 90 giây, sau đó đưa nhanh tế bào vào trong đá 2 phút
+ Bổ sung 700µl môi trường LB lỏng vào ống tế bào biến nạp, nuôi phục hồi
ở 370C trong thời gian 30 phút
+ Sau khi nuôi phục hồi lấy toàn bộ tế bào biến nạp nuôi trên môi trường chọn lọc thạch LB kana, thao tác nhanh, trang đều trên mặt thạch đến khi khô mặt thạch.
+ Nuôi ở 370C, qua đêm
3.6.2.1. Phương pháp tách chiết Plasmid
Để phân tích kết quả gen iEIB từ pR-SETA chuyển sang vector pET28 : tôi tiến hành lấy khuẩn lạc riêng rẽ nuôi trên môi trường LB lỏng , có bổ sung kháng sinh Kanamycin, nuôi ở 370 C, lắc 150 vòng/ phút.
3.6.2.1.1. Tách plasmid bằng phương pháp ankaline lysis
+ Thu cặn tế bào, ly tâm 5000 vòng/ 1 phút trong 3 phút + Bổ sung 200µl solution I, vortex cho tan hết cặn + Bổ sung 400µl solution II, mix nhẹ 6-8 lần + Bổ sung thêm 350µl solution III, mix nhẹ 6-8 lần
+ Ly tâm 10000 v/p trong 10 phút, thu dịch lỏng sang ống effpendorf mới + Bổ sung 700µl CIAA mix 6-8 lần, ly tâm 10000 v/p trong 10 phút
+ Thu dịch pha trên, sau đó bổ sung thêm 50µl CH3COOK + 800µl isopropanol, mix nhẹ. Đem ly tâm 1000v/p trong 20 phút
+ Loại bỏ dịch nổi, thu cặn thêm 1000µl EtOH 70% lạnh. Sau đó, ly tâm 10000v/p trong 1 phút
+ Ly tâm lần 2 ở 10000v/p trong 1 phút để loại bỏ hết EtOH + Thu cặn, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-7 phút + Bổ sung 50µl TE + 2µl RNase, mix đều
+ Điện di sản phẩm tách chiết
3.6.2.1.2. Tách plasmid bằng Kit “Gene JET plasmid Miniprep “
+ Ly tâm thu cặn khuẩn, 5000 v/p trong 3 phút
+ Bổ sung 250 µl Resuspension buffer vào ống tế bào, vortex tan dịch khuẩn + Bổ sung 250 µl Lysis buffer, đảo nhẹ 4-6 lần
+ Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút, thu dịch nổi
+ Sau đó ly tâm 10000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi
+ Chuyển cột lọc sang ống effendoft rồi bổ sung 500 µl washing buffer, ly tâm 1 phút
+ Loại bỏ dịch nổi, ly tâm thêm 1 phút để loại bỏ dịch
+ Chuyển sang ống effendoft mới, thêm 50µl Elution buffer, đợi 2 phút sau
đó ly tâm 10000 v/p trong 1 phút, thu được plasmid
3.6.2.3. Thành phần phản ứng cắt kiểm tra chiều gắn nối bằng enzyme giới hạn
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt XhoI Thành phần Thể tích (µl) plasmid 5 buffer 1 Enzyme XhoI 1 H2 O 3 Tổng 10
3.6.2.4. Kiểm tra gen gắn nối bằng phương pháp PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhân gen EIB với cặp mồi tương ứng
Mồi F- crtE TGCCGTAAATGTATCCGTTT
Mồi R- crtB CTAGAGCGGGCGCTGCCA
Với chu trình nhiệt như sau: 950C trong 45 giây
950C trong 30 giây
610C trong 45 giây 35 chu kỳ
720C trong 3 phút 40 giây 720C trong 10 phút
Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) PCR master mix 7,5 Mồi R 1 Mồi F 1 DNA 2 H2O 3,5 Tổng 15
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả thiết kế vector tái tổ hợp mang cụm gen iEIB trên nền tảng pET28 4.1 .Kết quả sàng lọc dòng tái tổ hợp
Kết quả cắt thu cụm gen iEIB bằng phản ứng cắt bằng enxym giới hạn
Cụm gen iEIB bao gồm 4 gen Idi, Crt E, Crt I và Crt B, nằm trong vùng giới hạn của 2 enzym XbaI và EcoRI. Vì vậy, để phân tách cụm gen trên tôi tiến hành cắt bằng 2 enzym XbaI và EcoRI. Phản ứng cát thành công khi sản phẩm cắt tạo thành hai băng sáng có kích thước tương ứng là 3958bp và một băng có kích thước khoảng 2655bp. Kết quảđiện di thể hiện trên hình 4.1
Hình 4.1. Kết quả cắt thu cụm gen iEIB từ pR-iEIB
Đường chạy 1: sản phẩm cắt pR-iEIB Đường chạy 2: sản phẩm cắt pET28
Đường chạy M: thang DNA chuẩn của hãng Thermo Sientific
Kết quảđiện di cho thấy đã cắt thành công cụm gen iEIB có kích thước 3958 bp.
Sàng lọc các dòng tái tổ hợp
Cụm gen iEIB bao gồm các gen Idi, Crt E, Crt I, CrtB. Với mục tiêu kiểm tra năng lực biểu hiện đa gen giữa hệ vector pRSET-A và pET28, cụm gen này được
chuyển từ vector pRSET-A sang pET28. Quá trình thực nghiệm được tiến hành như đã mô tảở hình 3.2. Tám dòng E. coli nghi ngờ mang pET28 chứa cụm gen iEIB, kí hiệu là pET28-iEIB, được sàng lọc bằng phương pháp điện di so sánh kích thước trên gel agarose. Kết quảđược thể hiện trên hình 4.2
Hình 4.2: Kết quảđiện di kiểm tra các dòng plasmid
Đường chạy 1,2,3,4,5,6,7,8: các dòng plamid pET28 -iEIB
Đường chạy M: đối chứng- vector pET 28
Kết quả diện di cho thấy, trong 8 dòng khuẩn lạc thu được chỉ có 5 dòng : dòng 2, dòng 3, dòng 5, dòng 7 và dòng 8 là có kích thước lớn hơn so với vector pET28 gốc, đây có thể là các vector pET28 được gắn gene iEIB. Các băng mờ phía trên có thể là các dạng plasmid khác nhau trong tế bào E. coli DH5α. Dòng 2,3,5,7,8
được tôi sử dụng chọn để sàng lọc các bước tiếp theo
Kết quả chọn lọc dòng mang pET28-iEIB bằng phương pháp lập bản đồ giới