Phương tiện nghiên cứu

3.1.1. Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ 06/2014 đến 12/2014.

Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

3.1.2. Nguyên liệu

- Rỉ đường, nước thải nhà máy đường và đất gần nhà máy đường Phụng Hiệp (1284 Trần Hưng Đạo, Quốc lộ 61, phường 7, Thị Xã Vị Thanh, Tỉnh Hậu Giang), nhà máy đường Casuco (số 10, Đường 1/5, phường Hiệp Thành, Thị Xã Tân Hiệp, Tỉnh Hậu Giang) và Công ty trách nhiệm hữu hạn Mía Đường Cồn Long Mỹ Phát (Thị trấn Long Mỹ, Huyện Long Mỹ, Tỉnh Hậu Giang).

- Men bia từ xưởng bia của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất

a. Thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm. Máy lắc ủ Eppendorf (Đức), lò vi sóng (Sanyo, Hàn Quốc), máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức), tủ lạnh để trữ mẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh vật (Incucell 111, Đức), tủ cấy vi sinh vật (Pháp), cân điện tử (Sartorius, Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbi- international, Đức), bộ micropipette P10, P20, P100, P1000 (Bio-Rad, USA), máy vortex (Đức).

Các dụng cụ khác: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh (Merck), eppendorf, đèn cồn, que cấy,…

b. Hóa chất

- Cồn 96 % (v/v), cồn 70 % (v/v), nước cất.

- Môi trường phân lập nấm men (Yeast Extract Glucose Peptone Tetracyline Agar). Thành phần trong 1000 mL môi trường:

Yeast extract 5 g

Peptone 5 g

D (+)-Glucose 20 g

Agar 20 g

3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phân lập nấm men 3.2.1. Phân lập nấm men

 Mục đích: Phân lập được các chủng nấm men thuần từ các nguồn nguyên liệu ban đầu.

 Phương pháp tiến hành:

 Thu mẫu:

 Mẫu men bia

 Mẫu rỉ đường, nước thải nhà máy đường và đất gần nhà máy đường,

 Mẫu được thu tại các địa điểm, mẫu được giữ trong túi nilon và được bảo quản trong điệu kiện lạnh.

 Nuôi tăng sinh nấm men:

 Môi trường nuôi tăng sinh:

Thành phần trong 1000 mL môi trường: Yeast extract 5 g

Peptone 5 g

D(+)-Glucose 20 g

Tetracyline 100 mg

 Môi trường tăng sinh được phân phối vào bình tam giác 250 mL (100 mL môi trường/bình), khử trùng trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121°C trong 20 phút và để nguội đến nhiệt độ môi trường xung quanh. Chuyển 2 gam mẫu vào bình môi trường,ủ lắc ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 24 giờ.

Bước cho môi trường và mẫu vào bình tam giác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.

 Cấy trải:

 Pha môi trường cấy trải:

Thành phần trong 1.000 mL môi trường: Yeast extract 5 g

Peptone 5 g

D (+)-Glucose 20 g

Agar 20 g

 Khử trùng môi trường, đĩa petri, ống nước cất pha loãng trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121oC trong 20 phút.

 Đổ môi trường vào đĩa petri.

 Pha loãng mẫu đã nuôi tăng sinh ở 4 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.

 Chuyển 10 µL dung dịch đã pha loãng lên đĩa petri chứa môi trường.

 Tiến hành trải mẫu.

 Úp ngược đĩa và cho vào tủ ủ ở 30oC trong 24 giờ.

Bước đổ môi trường, pha loãng và cấy trải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.

 Cấy chuyền.

 Thành phần môi trường cấy chuyền:

Thành phần có trong 1.000 mL môi trường: Yeast extract 5 g

Peptone 5 g

D (+)-Glucose 20 g

Tetracyline 100 mL

Agar 20 g

Khử trùng môi trường, đĩa petri trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121oC trong 20 phút.

Đổ môi trường vào đĩa petri.

Chọn khuẩn lạc rời cấy vào đĩa petri chứa môi trường mới.

Úp ngược đĩa và cho vào tủ ủ ở 30°C trong 24 giờ.

Bước đổ môi trường và cấy chuyển được thực hiện trong điều kiện vô trùng.

* Thực hiện cấy chuyển nhiều lần với từng loại khuẩn lạc khác nhau bằng hình thức cấy ria và ủ ở nhiệt độ như cấy trải.

 Thu nhận nấm men thuần:

 Kiểm tra độ thuần khiết của khuẩn lạc: độ nổi, màu sắc, bề mặt, dạng bìa.

3.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của nấm men

a. Đặc điểm hình thái

- Mục đích: Xác định các đặc tính về hình dạng và kích thước của khuẩn lạc và tế bào nấm men đã phân lập.

- Phương pháp tiến hành:

 Cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩa petri chứa môi trường phân lập (Yeast extract, Peptone, D-Glucose, Tetracyline, Agar).

 Ủ các đĩa Petri ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ.

 Ghi nhận hình dạng và kích thước khuẩn lạc các chủng nấm men.

 Làm tiêu bản các chủng nấm men quan sát dưới kính hiển vi để xác định hình dạng của tế bào và sử dụng trắc vi thị kính để đo kích thước tế bào nấm men.

- Quan sát hình thái nấm men: Quan sát, mô tả khuẩn lạc.

b. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men

* Kiểm tra khả năng lên men đường Saccharose và Maltose

+ Tiến hành nuôi tăng sinh các chủng nấm men: Lấy nấm men khoảng nửa vòng kim cấy từ ống thạch nghiêng chủng vào bình tam giác có chứa 100 mL môi trường tăng sinh đã được vô trùng rồi ủ lắc ở nhiệt độ môi trường xung quanh, trong 48 giờ.

+ Chủng nấm men vào ống nghiệm có chai Durham: Dùng pipet vô trùng hút 1 mL dung dịch nấm men đã tăng sinh cho vào chai Durham chứa 9 mL dung dịch saccharose 2% đã được khử trùng ở 121oC trong 20 phút.

+ Lắc thật đều để dung dịch đường tràn đầy vào bên trong chai Durham trong ống nghiệm, lên men ở nhiệt độ môi trường xung quanh

+ Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men của nấm men: chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược trong vòng 24 giờ, mỗi lần đo cách nhau 2 giờ, bắt đầu đo sau 4 giờ từ lúc bắt đầu thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.

+ Thực hiện các bước tương tự đối với dung dịch đường maltose.

* Xác định hoạt tính phân giải urea

- Mục đích: Phát hiện nấm men có mang enzym urease.

 Chuẩn bị môi trường Chistensen urea broth (Stuart, 1945): Thành phần trong 1.000 mL môi trường

Urea 20 g Yeast extract 0,1 g Na2HPO4 9,5 g K2HPO4 9,1 g Phenol red 0,01 g Chỉnh pH đến: 6,7±0,2

 Cho vào mỗi ống nghiệm 5 mL môi trường.

 Khử trùng môi trường và ống nghiệm ở 115oC trong 15 phút.

 Chủng các chủng nấm men phân lập được vào ống nghiệm có chứa môi trường Chistensen urea broth.

 Ủ ở 30oC trong 24 giờ.

 Kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ sẫm.

 Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại.

* Xác định khả năng phân giải gelatine

- Mục đích: Xác định khả năng phân giải gelatine của các chủng nấm men có enzyme gelatinase.

- Phương Pháp tiến hành:

+ Chuẩn bị môi trường gelatine (Difco Laboratories, 2009): Thành phần trong 1.000 mL môi trường:

Peptone 5 g

Gelatine 120 g

Yeast extract 3 g

Chỉnh pH đến: 6,8 ± 0,2

+ Hút 5 mL môi trường cho vào ống nghiệm.

+ Khử trùng ống nghiệm chứa môi trường ở 121oC trong 20 phút.

+ Chủng nấm men vào ống nghiệm: lấy nấm men khoảng nửa vòng kim cấy chủng vào môi trường, sau đó ủ ở 30oC trong 48 giờ.

+ Kết quả dương tính khi các ống nghiệm còn ở trạng thái lỏng do gelatine bị phân giải.

+ Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại.

3.2.3. Sơ tuyển nấm men có hoạt tính lên men

 Mục đích: Khảo sát lượng CO2 sinh ra của các chủng nấm men trong quá trình lên men để xác định tốc độ lên men.

 Phương pháp tiến hành:

Nuôi tăng sinh các chủng nấm men được chọn.

Ủ ở 30oC trong 24 giờ.

Chủng 100 µL dịch tăng sinh nấm men vào ống Durham có chứa 10 mL dung dịch đường glucose 2% đã được khử trùng ở 121oC trong 20 phút.

Lắc đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong chai Durham.

Đo chiều cao cột khí trong ống Durham sau 12, 18, 24, 30, 36, 42 và 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30oC để xác định khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men.

 Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.

 Tuyển chọn các chủng nấm men có hoạt tính lên men để thử nghiệm khả năng chịu nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau.

3.2.4. Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt

- Mục đích: Tuyển chọn được các chủng nấm men có khả năng phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ cao.

- Phương pháp tiến hành:

 Cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩa petri chứa môi trường phân lập (Yeast extract, Peptone, D-Glucose, Tetracyline, Agar).

 Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 35, 37, 40, 43, 45oC trong 48 giờ.

 Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các chủng nấm men ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau trên môi trường thạch.

 Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng phát triển mạnh ở điều kiện nhiệt độ cao và chịu được nồng độ cồn cao ở thí nghiệm trước.

3.2.5. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men

- Mục đích: xác định khả năng chịu rthanol của các chủng nấm men dựa vào sự phát triển của khuẩn lạc ở các nồng độ khác nhau.

- Phương pháp tiến hành:

 Khử trùng môi trường phân lập (Yeast extract, D-Glucose, Tetracyline, Agar) và đĩa Petri ở 121oC trong 20 phút.

 Để nguội môi trường sau đó bổ sung ethanol tinh khiết theo các nồng: 0%, 3%, 6%, 9% và 12% v/v.

 Chia đĩa Petri thành 6 phần.

 Cấy zigzag các chủng nấm men lên các phần được chia của đĩa petri.

 Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ 30oC. Theo dõi sự phát triển của nấm men sau 24-48 giờ trên bề mặt môi trường.

 Quan sát khả năng phát triển thành khuẩn lạc của các chủng nấm men.

 Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.

3.2.6. Khảo sát khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men

 Mục đích: Xác định khả năng tạo enthanol của các chủng nấm men đã tuyển chọn trên cơ chất rỉ đường.

 Phương pháp tiến hành:

Nuôi tăng sinh các chủng nấm men được chọn ở 30oC trong 24 giờ.

Thanh trùng rỉ đường bằng NaHSO3 (146 mg/L) trong 2 giờ (Nguyễn Thành Tâm, 2013).

Pha loãng dịch rỉ đến nồng độ 22o Brix, đo pH. Chuyển 100 mL dịch rỉ đường vào bình tam giác 250 mL.

Chủng 1 mL dịch tăng sinh nấm men vào dịch rỉ đường, đậy kín bình tam giác bằng waterlock, ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 30oC, 35oC, 37oC và 39oC trong 4 -7 ngày.

Đo pH và độ Brix sau quá trình lên men, chưng cất để xác định độ cồn.

3.2.7. Phương pháp phân tích

Số liệu sẽ được phân tích bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và phần mềm Minitab 16, USA.

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập nấm men

Từ 15 mẫu thu thập ở các nhà máy đường thuộc tỉnh Hậu Giang và nguồn nấm men bia của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Trường Đại học Cần Thơ, 27 chủng nấm men đã được phân lập Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học. Ký hiệu các chủng phân lập và địa điểm thu mẫu được trình bày trong Bảng 7.

Bảng 7. Nguồn nguyên liệu, địa điểm thu mẫu, tên các chủng nấm men phân lập

Stt Chủng nấm men

Nguồn phân lập Địa điểm thu mẫu

1 PHĐA1 Đất nhà máy đường Nhà máy đường Phụng Hiệp, Hậu Giang 2 PHĐA2 Đất nhà máy đường Nhà máy đường Phụng Hiệp, Hậu Giang 3 PHĐA3 Đất nhà máy đường Nhà máy đường Phụng Hiệp, Hậu Giang 4 PHHO Nước thải nhà máy đường Nhà máy đường Phụng Hiệp, Hậu Giang 5 LMHO Nước thải nhà máy đường Công ty trách nhiệm hữu hạn Mía Đường Cồn Long Mỹ Phát 6 LMM1 Bã mía nhà máy đường Công ty trách nhiệm hữu hạn Mía đường

Cồn Long Mỹ Phát

7 LMM2 Bã mía nhà máy đường Công ty trách nhiệm hữu hạn Mía Đường Cồn Long Mỹ Phát 8 LMĐA1 Đất nhà máy đường Công ty trách nhiệm hữu hạn Mía Đường Cồn

Long Mỹ Phát

9 LMĐA2 Đất nhà máy đường Công ty trách nhiệm hữu hạn Mía Đường Cồn Long Mỹ Phát 10 HO1 Nước thải nhà máy đường Nhà máy đường Casuco, Hậu Giang

11 HO3 Nước thải nhà máy đường Nhà máy đường Casuco, Hậu Giang 12 TR1 Đất trồng mía gần nhà máy đường Nhà máy đường Casuco, Hậu Giang 13 TR2 Đất trồng mía gần nhà

máy đường Nhà máy đường Casuco, Hậu Giang 14 TR3 Đất trồng mía gần nhà

máy đường Nhà máy đường Casuco, Hậu Giang 15 ĐA Đất nhà máy đường Nhà máy đường Casuco, Hậu Giang

16 M1 Men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 17 M2 Men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển

Công Nghệ Sinh Học

19 RĐ1N Rỉ đường Nhà máy đường Phụng Hiệp, Hậu Giang 20 RĐ21 Rỉ đường Nhà máy đường Phụng Hiệp, Hậu Giang 21 RĐ22 Rỉ đường Nhà máy đường Phụng Hiệp, Hậu Giang

22 BIA21 Men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 23 BIA23 Men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 24 BIA3 Men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển

Công Nghệ Sinh Học

25 BIA41 Men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 26 BIA42 Men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 27 MB Men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Quy tắc ký hiệu:

PH: mẫu thu ở nhà máy đường Phụng Hiệp.

LM: Công ty trách nhiệm hữu hạn Mía Đường Cồn Long Mỹ Phát HO: Nước thải nhà máy đường Casuco

TR: Đất trồng mía gần nhà máy đường Casuco ĐA: đất trong nhà máy đường Casuco. RĐ: Rỉ đường của nhà máy đường Phụng Hiệp

M, BIA: men bia Xưởng bia của Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học.

Các khuẩn lạc nấm men phát triển trên môi trường dinh dưỡng có đường kính khoảng từ 1-7 mm, đa số có khuẩn lạc tròn, một số ít có dạng không đều, bề mặt một số khuẩn lạc nổi mô, trong khi một số khác lại có độ nổi gò. Dạng bìa của khuẩn lạc chủ yếu là bìa nguyên và răng cưa. Về màu sắc, hầu hết có màu trắng đục, có hai chủng có khuẩn lạc màu xám đục. Tế bào chỉ có hai dạng chính là hình que và hình ovan. Đặc điểm hình thái của 27 chủng nấm men đã phân lập được thể hiện trong Bảng 8.

Bảng 8. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men

STT Tên Hình khuẩn lạc trên môi

trường YPD

Hình tế bào dưới kình hiển vi E100

Mô tả đặc điểm hình thái

1 PHĐA1

Khuẩn lạc: tròn, 3 mm, trắng đục.

Độ nổi: mô. Bìa: răng cưa. Tế bào hình ovan.

2 PHĐA2

Khuẩn lạc: tròn, 2 mm, trắng đục.

Độ nổi: mô. Bìa: nguyên. Tế bào hình ovan.

3 PHĐA3

Khuẩn lạc: không đều, 5 mm, trắng đục. Độ nổi: mô. Bìa: răng cưa. Tế bào hình ovan.

4 PHHO

Khuẩn lạc: tròn, 3 mm, trắng đục.

Độ nổi: nổi gò. Bìa: răng cưa. Tế bào hình ovan.

5 LMHO

Khuẩn lạc: không đều, 2 mm, trắng đục. Độ nổi: mô. Bìa: răng cưa Tế bào hình ovan

6 LMM1

Khuẩn lạc: tròn, 1,5 mm, trắng đục. Độ nổi: mô. Bìa: nguyên. Tế bào hình ovan.

7 LMM2

Khuẩn lạc: tròn, 3 mm, trắng đục.

Độ nổi: mô. Bìa: nguyên. Tế bào hình cầu.

8 LMĐA1

Khuẩn lạc: tròn, 5 mm, trắng đục.

Độ nổi: gò. Bìa: răng cưa. Tế bào hình ovan.

9 LMĐA2

Khuẩn lạc: tròn, 1,5 mm, trắng đục. Độ nổi: mô. Bìa: răng cưa. Tế bào hình ovan.

10 HO1

Khuẩn lạc: tròn, 2 mm, trắng đục. Độ nổi: mô. Bìa: nguyên. Tế bào hình que.

11 HO3

Khuẩn lạc: tròn, 3 mm,