Sự lên men ethanol - phân lập và tuyển chọn nấm me- 123docz.net

2.4.1. Khái quát về quá trình lên men ethanol

Ethanol được sản xuất từ các loại nguyên liệu thực vật chứa đường bằng phương pháp lên men vi sinh hoặc từ các loại nguyên liệu chứa tinh bột và cellulose thông qua phản ứng trung gian thủy phân thành đường. Hiện nay trên thế giới, nguyên liệu chứa đường và tinh bột được sử dụng phổ biến do chi phí sản xuất thấp.

Phản ứng hóa học tổng quát có thể viết tóm tắt như sau: C6H12O6 → 2 CH3CH2OH + 2 CO2

Lên men glucose thành ethanol được thực hiện bởi nhiều loại nấm men, chủ yếu là các loài Saccharomyces. Nguyên liệu lên men ethanol có thể chia thành 3 nhóm:

- Các cơ chất giàu đường như: rỉ đường, nước mía, củ cải đường, nước trái cây chín,… Sự lên men rượu xảy ra trực tiếp từ loại nguyên liệu này và không cần xử lý.

- Tinh bột từ các loại ngũ cốc như: lúa mì, gạo, ngô,… và các loại củ như khoai tây, sắn,… Ngũ cốc là nguồn nguyên liệu lớn từ trồng trọt, nhưng trước khi lên men phải được thuỷ phân thành glucose, rồi mới lên men đường glucose thành ethanol.

- Phức hợp lignocellulose từ gỗ, phế thải nông, lâm nghiệp, giấy in báo,… Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào nhất trên Trái đất từ sinh khối thực vật, nhưng việc xử lý phân cắt cellulose thành glucose khó khăn và tốn kém hơn nhiều.

Công nghệ gen đã tạo được chủng nấm men S. cerevisiae lên men cả đường xylose và nó làm tăng 40% sản lượng cồn khi lên men dịch thủy phân rơm rạ, bẹ ngô. (Nguồn: http://z11.invisionfree.com/Biotechnology/ar/t126.htm, ngày 28/07/2013).

Quá trình lên men đường thành ethanol bằng nấm men có vai trò quan trọng đối với nhiều quy trình được sử dụng trong ngành công nghiệp. Các chủng nấm men được quan tâm gồm có S. cerevisiae, S. uvarum (carlsbergensis) và Kluyveromyces. Bên cạnh sản phẩm phụ của quá trình lên men (thường là glycerol) tiêu thụ lên đến 4-5% trong tổng số cơ chất. Nếu giới hạn được những phản ứng này, kết quả sẽ có thêm 2,7% sản lượng ethanol thu được từ cơ chất (Roehr, 2001).

2.4.2. Cơ chế của quá trình lên men

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là

lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2. Quá trình lên men rượu được chia làm hai thời kỳ chính:

- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối.

- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2.Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Thông thường, khi lên men, lượng nấm men phải lớn hơn 10 triệu/1 mL dung dịch lên men. Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác được hấp thụ trên bề mặt nấm men, sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong, tạo ra rượu và CO2.

Rượu etylic tạo thành sẽ khuyếch tán ra bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên tốc độ khuếch tán rất nhanh. CO2 cũng hòa tan trong môi trường nhưng tốc độ hòa tan không lớn và nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa. Khi đó, CO2 bám xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên thành túi lớn, đến lúc nào đó sẽ có sự chênh lệch về khối lượng riêng giữa môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên. Khi nổi lên, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho CO2 phóng thích ra bên ngoài. Lúc này, khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng chìm xuống. Quá trình tế bào nấm men nổi lên rồi chìm xuống diễn ra liên tục làm cho nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang thái động, gia tăng khả năng tiếp xúc của tế bào với môi trường, gia tăng tốc độ lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2004).

Trong giai đoạn lên men phụ, sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hòa tan. Do đó, tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào khả năng thủy phân hàm lượng dextrin (không lên men) còn lại. Như vậy, chu kì lên men dịch đường phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hóa của phức hệ enzyme amylase. Rất nhiều thí nghiệm cho thấy rằng càng kéo dài thời gian lên men cuối hiệu suất quá trình lên men càng tăng.

Glucose Hexokinase Glucose – 6 – phosphate Phosphoglucose isomerase Fructose – 6 – phosphate PhosphoFructokinase Fructose – 1,6 – diphosphate Aldolase Triophosphat izomerase

Glyceraldehyde – 3 – phosphate Dihydroacetone phosphate Glyceraldehyde phosphatdehydrogenase Acid – 1,3 – diphosphoglyceric Phosphoglyceratkinase Acid – 3 – phosphoglyceric Phosphoglycerate-mutase Acid – 2 – phosphoglyceric Enoiase Acid phosphoenolpyruvic Pyruvate kinase

Acid – enol – pyruvic Acid pyruvic

Pyruvate – decarboxylase Ethanal

Aldodeshydrogenase

Ethanol

Hình 8. Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men (Teusink, 2000)

2.4.3. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men

 Ảnh hưởng của nồng độ đường

Nguyên liệu chính của quá trình lên men là glucid, nên nồng độ đường ảnh hưởng lớn đến hiệu suất lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ đường phù hợp từ 10-15%.

Nồng độ đường quá cao ức chế nấm men và năng lực lên men rượu giảm. Khi nồng độ đường 30-35% sự lên men gần như đình chỉ. Nếu nồng độ đường quá thấp, khả năng lên men cũng giảm.

 Dinh dưỡng

Nitơ và nguồn carbon là yếu tố dinh dưỡng chính trong môi trường lên men. Sự tương tác lẫn nhau của các chất dinh dưỡng có thể đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Các chất bổ sung vào môi trường có chứa maltose hoặc glucose cùng với nguồn nitơ như peptone sẽ làm giảm sinh khối và sản sinh ethanol (Helena de Cruz et al., 2003).

 Ảnh hưởng của oxy

Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2 và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pastuer: kìm hãm sự lên men rượu bằng oxy. Oxy là thành phần không thể thiếu được ở giai đoạn phát triển sinh khối. Với sự có mặt của oxy nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối.

Trong giai đoạn bảo quản chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyde, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn acid lactic, acid acetic,…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu 2 chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển).

Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ lượng oxy cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất. Tuy nhiên lại có một số nấm men phát triển nhanh và tạo ra hàm lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ oxy (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004).

 Ảnh hưởng của CO2

Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của nấm men rượu. Oxy như là một chất trao đổi, trong nồng độ xác định nó có tác dụng kìm hãm hoặc làm ngưng sinh sản của nấm men. Khi hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 0,25% trọng lượng việc sinh sản của nấm men đình trệ. Hàm

lượng CO2 trong rượu vang đạt 1,5% trọng lượng nấm men không còn sinh sản được nữa (Bùi Ái, 2003).

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có sự phát triển tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với chủng ưu nhiệt trung bình, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối là 350Cvà nhiệt độ thích hợp cho sự lên men là 40oC. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng giới hạn 28-32oC. Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Nếu làm lạnh dịch đường từ 20-22oC sẽ hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Sau 8-10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng lên 28- 30oC. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh chóng nhưng chủ yếu là nhiễm lactic và nấm men hoang dại, sản phẩm tạo ester và aldehyde. Ở nhiệt độ 30oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35-38oC chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).

Nhiệt độ là yếu tố cần thiết ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men. Thông thường nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28-30oC. Nhiệt độ khoảng hơn 50oC và dưới 0oC sự lên men hầu như bị đình trệ. Thông thường quá trình lên men ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất sản phẩm, cũng như ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm.

 Ảnh hưởng của pH

Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH 2,0-8,0 nhưng thích hợp nhất là 4,0-4,5. Vi khuẩn phát triển ở pH 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn từ 3,8-4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loại vi khuẩn do quen dần (thuần hóa) với độ pH thấp nên ngoài việc điều chỉnh pH thích hợp còn phải sử dụng các chất sát trùng. Khi pH đạt 8,0 pH nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH 3,8 nấm men phát triển mạnh hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là animo acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men.

Nồng độ của ion H+ có ảnh hưởng đáng kể đến sự lên men trong công nghiệp do pH đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn có thể bị nhiễm và

ảnh hưởng lên sự phát triển của nấm men. Năng suất lên men ethanol cao nhất thường dao động ở pH 4,5-4,7. Khi pH được điều chỉnh lên 7,0 hoặc cao hơn acid acetic được tạo thành acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehyde dehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al., 2001).

 Ảnh hưởng nồng độ ethanol

Nồng độ ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, nồng độ ethanol cao có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men. Rượu tạo ra trong quá trình lên men có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên men. Sản phẩm chủ yếu của quá trình kị khí là ethanol, ethanol kìm hãm hoạt động của tế bào nấm men, tuy nhiên tùy theo nồng độ. Thông thường nấm men lên men đến nồng độ cồn đạt 12-14%. Một số ít nấm men có thể lên men đạt nồng độ cồn 17-20%. Với nồng độ cồn cao hơn sẽ ức chế nấm men và kìm hãm lên men rượu. Việc chọn lọc chủng nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao sẽ mang lại lợi ích đáng kể cho quá trình lên men vì các chủng nấm men này có thể nâng cao hiệu suất của quá trình lên men.

Ngô Thị Phương Dung (2009) đã phân lập được 50 chủng nấm men từ viên men rượu, 9 chủng được chọn để khảo sát khả năng chịu cồn. Kết quả thử khả năng chịu đựng độ cồn cho thấy khả năng chịu đựng độ cồn trong khoảng 5-6% (w/v) ethanol và hai chủng có khả năng chịu đựng độ cồn thấp hơn từ 2,4-3,0% (w/v) ethanol.

 Ảnh hưởng nồng độ dịch lên men

Nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác, đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men. Ngược lại, nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và sẽ tốn hơi khi chưng cất, tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải.

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Phương tiện nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ 06/2014 đến 12/2014.

Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

3.1.2. Nguyên liệu

- Rỉ đường, nước thải nhà máy đường và đất gần nhà máy đường Phụng Hiệp (1284 Trần Hưng Đạo, Quốc lộ 61, phường 7, Thị Xã Vị Thanh, Tỉnh Hậu Giang), nhà máy đường Casuco (số 10, Đường 1/5, phường Hiệp Thành, Thị Xã Tân Hiệp, Tỉnh Hậu Giang) và Công ty trách nhiệm hữu hạn Mía Đường Cồn Long Mỹ Phát (Thị trấn Long Mỹ, Huyện Long Mỹ, Tỉnh Hậu Giang).

- Men bia từ xưởng bia của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất

a. Thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm. Máy lắc ủ Eppendorf (Đức), lò vi sóng (Sanyo, Hàn Quốc), máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức), tủ lạnh để trữ mẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh vật (Incucell 111, Đức), tủ cấy vi sinh vật (Pháp), cân điện tử (Sartorius, Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbi- international, Đức), bộ micropipette P10, P20, P100, P1000 (Bio-Rad, USA), máy vortex (Đức).

Các dụng cụ khác: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh (Merck), eppendorf, đèn cồn, que cấy,…

b. Hóa chất

- Cồn 96 % (v/v), cồn 70 % (v/v), nước cất.

- Môi trường phân lập nấm men (Yeast Extract Glucose Peptone Tetracyline Agar). Thành phần trong 1000 mL môi trường:

Yeast extract 5 g

Peptone 5 g

D (+)-Glucose 20 g

Agar 20 g

3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phân lập nấm men 3.2.1. Phân lập nấm men

 Mục đích: Phân lập được các chủng nấm men thuần từ các nguồn nguyên liệu ban đầu.

 Phương pháp tiến hành:

 Thu mẫu:

 Mẫu men bia

 Mẫu rỉ đường, nước thải nhà máy đường và đất gần nhà máy đường,

 Mẫu được thu tại các địa điểm, mẫu được giữ trong túi nilon và được bảo quản trong điệu kiện lạnh.

 Nuôi tăng sinh nấm men:

 Môi trường nuôi tăng sinh:

Thành phần trong 1000 mL môi trường: Yeast extract 5 g

Peptone 5 g

D(+)-Glucose 20 g

Tetracyline 100 mg

 Môi trường tăng sinh được phân phối vào bình tam giác 250 mL (100 mL môi trường/bình), khử trùng trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121°C trong 20 phút và để nguội đến nhiệt độ môi trường xung quanh. Chuyển 2 gam mẫu vào bình môi trường,ủ lắc ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 24 giờ.

Bước cho môi trường và mẫu vào bình tam giác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.

 Cấy trải:

 Pha môi trường cấy trải:

Thành phần trong 1.000 mL môi trường: Yeast extract 5 g

Peptone 5 g

D (+)-Glucose 20 g

Agar 20 g

 Khử trùng môi trường, đĩa petri, ống nước cất pha loãng trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121oC trong 20 phút.

 Đổ môi trường vào đĩa petri.

 Pha loãng mẫu đã nuôi tăng sinh ở 4 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.