- Phương phâp 4: Phương phâp ựiện di SDSPAGE: Băng thơm ựược xâc ựịnh ở vị trắ 24,4 Kda, tùy theo mức ựộ ựậm nhạt của băng protein mă ựânh giâ mù
3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU
3.1 Vật liệu, ựịa ựiểm vă thời gian nghiắn cứu
3.1.1 Vật liệu nghiắn cứu
Bao gồm 4 giống ựối chứng (2 ựối chứng thơm, 2 ựối chứng không thơm), 26 dòng triển vọng trong tập ựoăn vật liệu câc dòng, giống lúa chất lượng do bộ môn Công nghệ Sinh học lai tạo (câc dòng ở thế hệ F8 Ờ F10) dòng do nuôi cấy bao phấn ở thế hệ DH5, DH6) Số TT Ký hiệu dòng Nguồn gốc Thế hệ 1 G1 BT7 (đ/C thơm 1) 2 G2 HT1 (đ/C thơm 2) 3 G3 Q5 (đC không thơm 1) 4 G4 KD18 (đ/C không thơm 2) 5 G5 HDT2 (Perai/BT7) DH6 6 G6 HDT4 (AC5/Q5//C70) F10 7 G7 HDT5 (AC5/Q5//AC4) F9 8 G8 HDT7 (CL8/D100) F9 9 G9 HDT8 (Perai/P6//HT1) DH6 10 G10 BT7/IR64 F9 11 G11 HT1/AC5/HT1 DH6 12 G12 AC5/N19 F9 13 G13 Nghi hương/N19 F9 14 G14 AC15/P6 F9 15 G15 AC15/Q5 F8 16 G16 BT7/đB6 F9 17 G17 CL8/ST F8 18 G18 BT7/LT2 F9 19 G19 P6/Sóc trăng F9 20 G20 CL8/LT3 F9 21 G21 CL8/AC5 F9 22 G22 AC15/Q5 F8 23 G23 CL8/LT2 F9 24 G24 Jasmin/ST F8 25 G25 AC15/CH133 F9 26 G26 BB24/AC5 DH5 27 G27 HT1/LT2 DH5 28 G28 AC5/BB1-4 F8 29 G29 AC15/đB1 F9 30 G30 CL8/P6 F9
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
*Câc chỉ thị pshđn tử gồm: BADH2 gồm 4 mồi ESP, IFAP, INSP vă EAP; RM339; RG28; L05
3.1.2. Trang thiết bị sử dụng
Câc thiết bị sử dụng trong chiết tâch AND, PCR vă ựiện di sản phẩm PCR bao gồm: Thiết bị ựồng hóa mẫu, mây li tđm lạnh tốc ựộ cao, tủ bảo quản mẫu, mây nhđn gen thường, mây nhđn gen real time PCR, mây ựiện di ngang, ựiện di ựứng vă ựiện di mao quản, chụp hình gel, mây lắc gelẦ
3.1.3. Thời gian vă ựịa ựiểm nghiắn cứu
- Thời gian nghiắn cứu thực hiện văo vụ mùa năm 2012 vụ xuđn năm 2013. - địa ựiểm:
+ Thắ nghiệm trong phòng: Tại Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Cđy lương thực Ờ CTP, Gia Lộc, Hải Dương.
+ Thắ nghiệm trắn ựồng ruộng: Tại khu thắ nghiệm ựồng 1 thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Cđy lương thực Ờ CTP, Gia Lộc, Hải Dương.
3.2. Nội dung nghiắn cứu
- đânh giâ ựặc ựiểm nông sinh học, năng suất, câc yếu tố cấu thănh năng suất, mức ựộ nhiễm sđu bệnh của câc dòng, giống.
- Xâc ựịnh gen thơm của câc dòng, giống lúa nghiắn cứu bằng chỉ thị phđn tử. - đânh giâ câc ựặc ựiểm về chất lượng hạt gạo của câc dòng, giống có tắnh thơm sau thanh lọc (Kiểm tra lại mùi thơm của câc dòng giống bằng phương phâp ựânh giâ cảm quan)
3.3. Phương phâp nghiắn cứu
Thắ nghiệm 1: đânh giâ câc dòng trắn ựồng ruộng vụ Mùa 2012 tại Gia Lộc Ờ Hải Dương.
- Thắ nghiệm ựược bố trắ theo kiểu tuần tự không nhắc lại
- Diện tắch ô thắ nghiệm 10m2, tổng diện tắch thắ nghiệm lă 1000m2. - Kỹ thuật âp dụng:
+ Mật ựộ cấy 45 khóm/m2, cấy 1 dảnh/khóm. + Thời vụ: trong vụ mùa 2012
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36 + Chăm sóc lăm cỏ, phương phâp bón phđn, phòng trừ sđu bệnh âp dụng như sản xuất ựại tră.
- Câc chỉ tiắu theo dõi:
+ Chiều cao cđy cuối cùng
+ Tổng thời gian sinh trưởng (từ gieo ựến thu = 95% hạt chắn) + Khả năng ựẻ nhânh: số nhânh, số nhânh hữu hiệu
+ Câc yếu tố cấu thănh năng suất (Bông/m2; Số hạt/bông; Tỷ lệ hạt chắc; Khối lượng 1000 hạt).
NSLT (tạ/ha) = (Số bông/m2 x Số hạt/bông x % hạt chắc x Khối lượng 1000 hạt (g ) x10-3
Thắ nghiệm 2: Sử dụng chỉ thị phđn tử xâc ựịnh sự có mặt của gen thơm ở câc dòng, giống trong tập ựoăn vật liệu vụ Mùa 2012
2.1. Sử dụng chỉ thị phđn tử kiểm tra: RM339; LO5; RG28 vă BADH2 ựể xâc ựịnh chỉ thị phđn tử liắn kết chặt với gen thơm. ựể xâc ựịnh chỉ thị phđn tử liắn kết chặt với gen thơm.
* Thănh phần dung dịch chiết tâch DNA
Thănh phần Nồng ựộ dung dịch mẹ Nồng ựộ dung dịch lăm việc
Tris- HCl (pH=8) 1,0M 0.01 M EDTA (pH=8) 0,5M 0,05 M SDS 10,0 % 1,0% NaCl 0.5M 0.05 M H2O * Thănh phần dung dịch ựệm TE Thănh phần Nồng ựộ dung dịch mẹ Nồng ựộ dung dịch lăm việc 50ml dung dịch TE lăm việc Tris- HCl (pH=8) 1,0M 10mM 0,5ml EDTA (pH=8) 0,5M 1mM 0,1ml H2O 49,4ml
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
* Quy trình chiết tâch DNA
Thu ngắt mẫu lâ khỏe, 14 ngăy tuổi dăi khoảng 2cm bỏ văo ống nghiệm có dung tắch 1,5 ml ựânh dấu tắn giống rồi bỏ văo ựâ lạnh.
Trong phòng thắ nghiệm câc cối chăy sứ ựê dược hấp khử trùng ựặt trong ựâ lạnh. 100mg mẫu lâ ựược nghiền nhỏ trong 800 dung dịch ựệm chiết (NaCl 0,05M, SDS 1%, EDTA 0,05M, TrisHCl 0,01M) bằng cối chăy sứ. Hồn hợp ựược ủ ở nhiệt ựộ 650C trong 30 phút rỗi thắm 100ộl CH3COOK 5M, trộn ựều vă ựể trắn ựâ -200C trong 20 phút, sau ựó ly tđm ở tốc ựộ 12000 vòng/phút trong 15 phút. Thu vă chuyển phần dung dịch phắa trắn sang ống 1,5 ml mới.
Thắm văo ống 300 ộl dung dịch propanol, ựể ở nhiệt ựộ phòng 30 phút, ly tđm 12.000 vòng/phút rồi thu chất kết tủa vă rửa bằng Ethnol 80% ựể khô trong 10 phút. Hoă tan ADN trong 200ộl TE, thắm văo 1ộl Rnase, ủ trong khoảng thời gian 30 phút, thắm văo 10ml CH3COONa vă 200ộl Ethanol 100% trộn ựều vă ựể ở nhiệt ựộ phòng 30 phút, ly tđm 12.000 vòng/phút rồi thu kết tủa ADN ở ựây ống nghiệm.
Rửa phần kết tủa bằng Ethanol 70%, ựể khô. Cho TE văo ựể sử dụng, bảo quản ở nhiệt ựộ -20oC.
* Kiểm tra ựộ nguyắn vẹn vă tinh sạch của DNA thu ựược
- độ nguyắn vẹn: 1 ộl DNA + 7 ộl TE + 2 ộl loadding dye 6X trộn lẫn rồi nhỏ văo câc giếng trắn bản gel agarose 1%, chạy ựiện di với U = 65V, 60 phút. Nhuộm bằng Ethidium bromide sau ựó quan sât hình ảnh ựiện di vă ựânh giâ.
- độ tinh sạch DNA: đo bằng mây Nanodrop 1000 nếu tỷ số OD260/OD280
trong phạm vi 1.8 - 2.0 thì mẫu ựó ựược coi lă sạch