- Phương phâp 4: Phương phâp ựiện di SDSPAGE: Băng thơm ựược xâc ựịnh ở vị trắ 24,4 Kda, tùy theo mức ựộ ựậm nhạt của băng protein mă ựânh giâ mù
2.4. Nghiắn cứu ứng dụng chỉ thỉ phđn tử trong chọn tạo giống lúa thơm
J. Nagaraju et al., (2002) [48] ựê nghiắn cứu ứng dụng hệ thống marker có hiệu quả ựể tìm hiểu mối quan hệ di truyền ở lúa Basmati ựê tiến hóa (EB) vă basmati ựịa phương (NB), vă giống thấp cđy bản ựịa. Một bộ gồm 3 nhóm giống ựê ựược phđn tắch bằng 19 marker SSR vă 12 mồi ISSR- PCR(inter-SSR-PCR). Tổng số 70 allels vă 481 inter-SSR-PCR ựê chứng minh 24 giống của 3 nhóm. đa dạng di truyền thấp nhất ở nhóm giống Basmati ựịa phương, trong khi nhóm giống EB biểu hiện ựa dạng di truyền cao nhất với cả hai marker. Những kết quả năy chỉ ra rằng bộ phụ của câc giống lúa thơm nghiắn cứu có thể bắt nguồn từ một giống bản ựịa. Giống Basmati ựịa phương vă giống thấp cđy mô tả rõ răng bằng hai marker. Một số marker phđn biệt không rõ câc giống Basmati ựịa phương (TB) với câc giống Basmati ựê tiến hóa (EB). Câc marker năy có tiềm năng sử dụng trong câc chương trình chọn tạo giống lúa Basmati.
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 22 để cải tiến những giống lúa thơm, kỹ thuật sinh học phđn tử ựược coi lă một giải phâp hiệu quả. Ahn et al., (1992) [25] ựê xâc ựịnh bằng kỹ thuật RFLP marker RG28 nằm trắn NST số 8 liắn kết với tắnh trạng biểu hiện mùi thơm ở khoảng câch 4,5 cM. Tuy nhiắn, phương phâp năy khâ ựắt tiền vă phức tạp nắn nhiều tâc giả ựê nghiắn cứu ựơn giản hóa phương phâp xâc ựịnh gen thơm. Tại Hội nghị Quốc gia chọn tạo giống lúa năm 2004, Nguyễn Thị Lang vă cs. (2004) [13] bâo câo hai mồi RG28F-R vă RM223 có thể sử dụng trong chương trình chọn giống lúa thơm. đồng thời, Nguyễn Thị Lang vă cs. (2008) [53] ựê sử dụng 2 mồi trắn ựể xâc ựịnh tắnh thơm trắn OM4900 (cặp lai C53/Jasmine 85) vă trắn OM6161 (cặp lai C51/Jasmine 85) vă cho rằng hai chỉ thị phđn tử năy sẽ giúp phât hiện ở quần thể phđn ly F2 có chứa gen fgr trong câc câ thể. Cũng ứng dụng câc mồi năy, Nguyễn Thị Lang (2010) [52] xâc ựịnh 16 giống lúa ựịa phương vă 49 giống lúa cải tiến ựều chứa gen thơm vă có mùi thơm.
Theo Chau Tan Phat et al., (2011) [32] 2-acetyl-1-pyrroline, một ứng dụng có lợi nhất của chọn tạo giống lúa nhờ marker phđn tử, lai lại nhờ marker (MAB) lă một tiếp cận ựẩy nhanh vă chuyển gen hiệu quả văo một giống phổ biến. Trong tiếp cận năy câc ựặc ựiểm mong muốn của bố, nền di truyền của bố mẹ cho gen mẹ còn ựược chọn lọc marker. Câc tâc giả nghiắn cứu 20 dòng F1 sử dụng lă nguồn gen thơm lai giữa giống lúa lai thơm ưu tú (Oryza sativa) indica với giống lúa không thơm. Phđn tắch liắn kết giữa marker (Sequence taged site -STS) vă locus thơm của câc cđy F1 thơm, vùng gen thơm trắn nhiễm sắc thể số 8 ựược gắn marker RG28F-R của STS
M.S, Madhav et al., (2010) [60] ựê chỉ ra rằng trong tất cả những ựặc ựiểm chất lượng, mùi thơm (aroma hoặc fragrance) lă tắnh trạng ựem lại giâ trị cao ựối với lúa gạo. Kểu gen lúa ựịa Phương Basmati lă lúa thơm vă hạt dăi, chất lượng nấu nướng tốt nhưng nhìn chung năng suất thấp. Câc nhă tạo giống quan tđm phât triển giống lúa năng suất cao nhưng mang gen chất lượng của Basmati, do vậy cần nghiắn cứu nhận biết tắnh trạng mùi thơm trong quần thể tạo giống. đânh giâ mùi thơm bằng phương phâp cảm quan truyền thống có sai lệch, công cụ di truyền chọn lọc nhờ marker phđn tử (MAS) lă một phương phâp hỗ trợ quan trọng trong chọn tạo giống lúa thơm dựa trắn kiểu hình truyền thống. Mùi thơm có liắn kết với tăng
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 23 thănh phần hợp chất 2-acetyl-1-pyrroline (2-AP) (Buttery et al., 1983) [31]. Ngăy nay ựược biết ựơn gen lặn (fgr) lă kiểm soât tắnh trạng mùi thơm vă xâc ựịnh bằng mức 2- AP (Lorieux et al., 1996) [57]. Gen fgr ựê ựược lập bản ựồ di truyền trắn NST số 8 bằng marker RFLP, gần nhất với marker RG28 với khoảng câch di truyền lă 4,5 cM (Ahn et al.,1992; Lorieux et al., 1996) [25], [96]. Trắn cơ sở nghiắn cứu lập bản ựồ di truyền của gen, nhiều marker phđn tử ựê ựược phât triển ựể nhận biết gen. Marker SSR cũng ựược sử dụng ựể phđn biệt câc dòng, giống mang gen thơm vă không mang gen thơm.
Ray Choudhury et al., (2001) [67] ựê nhận biết vă phđn loại câc kiểu gen lúa thơm, bằng sử dụng 58 mồi ngẫu nhiắn của marker RAPD trong nghiắn cứu. Hầu hết câc mồi năy do tìm thấy ựa hình (96.5%) giữa câc kiểu gen. Trong số 465 band khuyếch ựại, 314 cho ựa hình. Phđn tắch ựâm trắn cơ sở hệ số ựồng hình Jaccard sử dụng UPGMA ựể nhóm tất cả câc giống ựịa phương cao cđy, phản ứng ânh sâng, năng suất thấp, hạt dăi văo cùng nhóm ỔbasmatiỖ thơm. Câc giống lúa thóm hạt ngắn hình thănh một nhóm khâc vă mức trung bình ựồng hình cao giữa chúng. Cđy phả hệ trắn cơ sở 58 mồi ựê cho ựồng hình cao với 10 vă 15 mồi có tương quan (r) lă 0.88 vă 0.91. điều năy gợi ý rằng một bộ 10 mồi có thể sử dụng ựể ựânh giâ ựa dạng di truyền của một số lớn nguồn gen. Tất cả câc nguồn gen lúa nghiắn cứu có thể phđn biệt với mỗi nghiắn cứu khâc tại mức 19 ựến 186 band ựa hình giữa câc câ thể trong một cặp so sânh qua tất cả 58 mồi. độ tin cậy nhận biết mô tả khoảng 1041 kiểu gen khâc nhau nhận biết ựược khi so sânh DNA khâc nhau của marker RAPD sử dụng từ 58 mồi. Một biểu ựồ mô hình biểu hiện của DNA khâc nhau ở lúa thơm khâc nhau trắn cơ sở 10 mồi thông tin di truyền ựê ựược câc tâc giả phât triển.
Nghiắn cứu về betaine aldehyde dehydrogenase 2 (BADH2) bị mất chức năng thông qua tiến trình chọn lọc tự nhiắn biến thănh gen kiểm soât mùi thơm (Bradbury et al., 2005) [30], Chen et al., (2008) [33] ựê cho biết hoạt ựộng của cặp alen badh 2.1 mang về chất ban ựầu cần thiết cho sinh tổng hợp 2-AP. Một số tâc giả ựê chứng minh sự mất ựoạn 8 bp vă 3 ựiểm ựa hình ựơn trong exon thứ 7 của gen thơm (fgr) mê hóa betain aldehyde dehydrogenase 2 lăm enzyme năy không hoạt ựộng, kết quả lă tắch lũy 2-AP (Lorieux et al., 1996; Bradbury et al., 2005;
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 Vanavichit et al., (2008) [57], [30]. Trắn sơ sở ựó, Bradbury et al., (2005) [30] ựê sử dụng ASA với phản ứng PCR ựể phđn biệt gen thơm ựồng hợp tử lặn, dị hợp tử vă ựồng hợp tử trội. Hai mồi (EAP vă ESP) khuếch ựại một ựoạn khoảng 580 bp (577 bp ở lúa thơm vă 585 bp ở lúa không thơm). Hai mồi IFAP vă ESP hoạt ựộng tạo ra sản phẩm có kắch thước 257 bp cho lúa thơm. Hai mồi INSP vă EAP hoạt ựộng tạo ra sản phẩm có kắch thước 355 bp cho lúa không thơm
Hai cặp mồi ựược sử dụng trong phđn tắch PCR
Tắn mồi 5Ỗ Trình tự mồi 3Ỗ Mồi (ESP) Mồi (EAP) Mồi (IFAP) Mồi (INSP) TTGTTTGGAGCTTGCTGATG AGTGCTTTACAAAGTCCCGC CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA
Hai cặp mồi năy do Bradbury et al., (2005) [30] dựa trắn trình tự của BAC AP004463, gen thơm ước ựoân J023088C02, chỉ thị phđn tử vi vệ tinh SSR-J02 vă chỉ thị phđn tử SNP RSP04 ựể thiết kế. Dương Xuđn Tú, (2010) [20] cho biết, câc chỉ thị phđn tử RG28, RM342 không phđn biệt ựược câc giống lúa mang gen thơm vă không mang gen thơm; chỉ thị phđn tử L05 có thể phđn biệt ựược giữa câc giống lúa thơm vă không thơm, nhưng ựộ chắnh xâc không cao; badh2.1 ựê phđn biệt chắnh xâc 100%. Ứng dụng câc mồi do Bradbury et al., (2005) [30] công bố, Trần Thị Xuđn Mai vă cs. (2008) ựê cho biết việc sử dụng chung hai cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR ựê cho phĩp nhận diện câc câ thể thơm ựồng hợp tử, không
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 25 thơm ựồng hợp tử vă dị hợp tử trong một quần thể còn phđn ly của lúa thơm, phương phâp năy có thể âp dụng trong công tâc chọn tạo giống lúa thơm phục vụ nhu cầu trong nước vă xuất khẩu hiện nay. Sử dụng 2 cặp mồi năy ựê nhanh chóng chọn chắnh xâc ựược câc câ thể thơm trong quần thể. Tâc giả Nguyễn Phúc Hảo vă cs. (2009) [10] ựê sử dụng 2 cặp mồi năy ựể xâc ựịnh alen thơm của bốn dòng lúa thơm TP5 vă cho rằng tất cả ựều mang alen thơm từ lúa Jasmine 85. đồng thời, Nguyễn Thị Mai Hạnh vă cs, (2010) [11] ựê dùng 2 cặp mồi vừa nắu kết hợp kỹ thuật ựiện di protein tổng số ựê chọn ựược bốn dòng lúa thơm thuần. Dương Xuđn Tú (2010) [20] cũng chọn ựược 2 dòng lúa thơm Hải Dương thơm 2 vă Hải Dương thơm 8. Phan Hữu Tôn vă cs. (2010) dùng mồi ESP vă IFAP ựể săng lọc câc giống lúa thơm ựê chọn ựược 2 dòng lúa T33 vă T12. Quan Thị Âi Liắn vă cs. (2010) [16] lai tạo ựược 3 dòng nếp mang cặp alen badh2.1. Boonsirichai el al., (2007) [27] xâc ựịnh 3 dòng lúa của Khao Dawk Mali 105 ựột biến ựều mang cặp alen badh 2.1. Alen thơm còn ựược sử dụng ựể chuyển văo lúa lai 3 dòng. đânh giâ mùi thơm trắn câc giống thuộc nhóm Basmati vă giống cải tiến ở Sri Lanka, Kottearachchi et al.,
(2010) [50] cho biết 2 giống lúa thơm cải tiến Lanka Samurdi vă AT306 ựều mang cặp alen badh2.1 vă một giống Basmati trồng ở SriLanka (Acc No. 4920) có alen khâc với badh2.1. Jin et al., (2010) [46] ựê thiết kế mồi cho alen thơm badh2.7 ựể chuyển văo dòng duy trì bất dục II 32B.
Giovanni M. Cordeiro et al., 2002 [42] Cũng chỉ ra rằng hợp chất hóa học 2- acetyl-1-pyrroline (AP) ựược coi lă thănh phần quan trong nhất với tắnh trạng mùi thơm ở kiểu lúa thơm Basmati vă Jasmine. Chất AP ựược tìm thấy ở tất cả câc phần của cđy ngoại trừ rễ lúa. Người ta tin tưởng rằng một ựơn gen lặn kiểm soât mùi thơm ở hầu hết câc giống lúa. Dò tìm mùi thơm có thể thực hiện bằng cảm quan hoặc phương phâp hóa học, mỗi phương phâp ựều có những tiến bộ vă hạn chế nhất ựịnh. để khắc phục câc nhă nghiắn cứu ựê khâm phâ một marker vi vệ tinh lặp lại học SSR lă (AT)40 nhận biết câc allel thơm vă không thơm của gen fgr. Sự nhận biết marker năy hỗ trợ thông qua sử dụng 2 thông tin trình tự của cơ sở dữ liệu trình tự lúa Monsanto. 50 câ thể F2 từ quần thể lập bản ựồ di truyền ựê ựược ựânh giâ ựa hình kiểu gen bằng marker. Những marker năy có nội dung thông tin ựa hình cao
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 (PIC = 0.9). Câc marker SSR khâc liắn kết với mùi thơm cũng có thể nhận biết bằng cùng một phương phâp năy sử dụng quần thể khâc. điều năy chứng minh rằng phđn tắch trình tự genome của lúa lă lựa chọn ựể nhận biết marker có hiệu quả trong cải tiến giống lúa.