Để xỏc định cụng thức phõn tử của cỏc phức chất tổng hợp được trong luận văn này, chỳng tụi sử dụng phương phỏp phõn tớch hàm lượng kim loại trong phức chất và phương phỏp phổ khối lượng.
Cấu tạo của cỏc phức chất và cỏch phối trớ của cỏc phối tử tổng hợp được nghiờn cứu bằng cỏch sử dụng cỏc phương phỏp phổ hiện đại như: phổ hấp thụ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H và 13C, phổ hấp thụ electron.
Khả năng khỏng khuẩn, khỏng nấm của cỏc phối tử và phức chất đều được nghiờn cứu và đỏnh giỏ qua chỉ số IC50.
2.1.2. Húa chất
Cỏc húa chất được sử dụng trong tổng hợp đều là cỏc húa chất tinh khiết. Một số húa chất dựng làm dung mụi hay chất chỉ thị được sử dụng đều là cỏc húa chất tinh khiết dựng trong phõn tớch của Trung Quốc. Cỏc dụng cụ thớ nghiệm và quỏ trỡnh tổng hợp được thực hiện tại phũng thớ nghiệm Húa sinh vụ cơ, Bộ mụn Húa vụ cơ, Khoa Húa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiờn, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Húa chất TT
Tờn húa chất Xuất xứ
1 Thiosemicacbazit Merk (Đức)
2 N(4) - phenyl thiosemicacbazit Merk (Đức)
3 Benzanđehit Merk (Đức)
4 ZnCl2 Trung Quốc
27
2.1.3. Kỹ thuật thực nghiệm 2.1.3.1. Cỏc điều kiện ghi phổ
Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) của cỏc chất được ghi trờn mỏy quang phổ FR/IR 08101 của hĩng Shimadzu trong khoảng từ 4000 - 400 cm-1, tại Viện Hoỏ Học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Mẫu được chế tạo theo phương phỏp ộp viờn với KBr.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H và 13C được ghi trờn mỏy Avance - 500 MHz (Bruker) ở 300 K, trong dung mụi DMSO - d6, tần số ghi phổ cộng hưởng từ proton là 500 MHz, tần số ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C ở 125 MHz, tại Viện Hoỏ học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng (MS) được ghi trờn mỏy Varian MS 320 3Q - Ion Trap theo phương phỏp ESI tại Phũng cấu trỳc, Viện Hoỏ học, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Dung mụi được sử dụng là DMF, điều kiện ghi mẫu: vựng đo m/z : 50 - 2000; ỏp suất phun mự 30 psi; tốc độ khớ làm khụ 8 lit/ph; nhiệt độ làm khụ 325oC; tốc độ khớ 0,4 ml/ph; chế độ đo possitive.
Phổ hấp thụ electron UV-Vis của chất được ghi trờn thiết bị đo phổ hấp thụ UV-Vis -NIR tại viện Vật liệu - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Mẫu được chụp ở dạng bột mịn.
Hoạt tớnh sinh học của cỏc hợp chất được thử tại Phũng thử hoạt tớnh sinh học, Viện Húa học, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.1.3.2. Xỏc định hàm lượng kim loại trong phức chất
Để xỏc định hàm lượng ion kim loại trong cỏc phức chất chỳng tụi sử dụng phương phỏp chuẩn độ complexon.
a. Phỏ mẫu phức kẽm hoặc đồng.
Cõn chớnh xỏc một lượng mo gam mẫu trong khoảng 0,03 ữ 0,05 gam, chuyển vào bỡnh Kendan. Thấm ướt mẫu bằng vài giọt H2SO4 đặc rồi đun trờn bếp điện cho tới khi mẫu tan hết. Để nguội một ớt, rồi nhỏ vào đú 2 ml dung dịch H2O2 30%, tiếp tục đun cho tới khi cú khúi trắng thoỏt ra. Lặp lại cụng đoạn như vậy cho
28
tới khi thu được dung dịch trong suốt cú màu vàng trắng đối với phức của Zn(II), màu xanh nhạt đối với phức của Cu(II), để nguội dung dịch thu được, trước khi tiến hành xỏc định hàm lượng ion kim loại trong phức chất như dưới đõy.
b. Xỏc định hàm lượng kẽm trong phức chất
Để nguội dung dịch thu được, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50ml. Hỳt 10ml dung dịch Zn(II) vào bỡnh nún 250ml thờm ớt chỉ thị murexit, điều chỉnh mụi trường bằng dung dịch NH3 loĩng tới khi pH = 8 (dung dịch cú màu vàng nhạt) rồi chuẩn độ bằng EDTA nồng độ C mol/l tới khi dung dịch chuyển sang màu tớm (hết V ml EDTA). Hàm lượng Zn(II) trong mẫu được tớnh theo cụng thức sau:
c. Xỏc định hàm lượng đồng trong phức chất
Để nguội dung dịch thu được, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50ml. Hỳt 10ml dung dịch Cu(II) vào bỡnh nún 250ml thờm ớt chỉ thị murexit, điều chỉnh mụi trường bằng dung dịch NH3 loĩng tới khi pH = 8 (dung dịch cú màu vàng nhạt) rồi chuẩn độ bằng EDTA nồng độ C mol/l tới khi dung dịch chuyển sang màu tớm (hết V ml EDTA). Hàm lượng Cu(II) trong mẫu được tớnh theo cụng thức sau:
% mC u= V x C x 6 4 5 0 1 0 1 0 0 0 x mo x 100 % 2.1.3.3. Thăm dũ khả năng khỏng khuẩn, khỏng nấm của cỏc phối tử và cỏc phức chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trờn phương phỏp pha loĩng đa nồng độ. Đõy là phương phỏp thử nhằm đỏnh giỏ mức độ khỏng vi sinh vật kiểm định và nấm mạnh hay yếu của cỏc mẫu thử thụng qua cỏc giỏ trị IC50
29
(50% inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50%). Cỏc chủng vi sinh vật kiểm định gồm cỏc vi khuẩn và nấm kiểm định gõy bệnh ở người:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường khụng gõy bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gõy mủ cỏc vết thương, vết bỏng,
gõy viờm họng, nhiễm trựng cú mủ trờn da và cỏc cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lờn men cú
ớch, thường cú mặt trong hệ tiờu hoỏ của người và động vật.
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gõy một số bệnh về đường tiờu hoỏ như viờm
dạ dày, viờm đại tràng, viờm ruột, viờm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gõy nhiễm
trựng huyết, cỏc nhiễm trựng ở da và niờm mạc, gõy viờm đường tiết niệu, viờm màng nĩo, màng trong tim, viờm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gõy bệnh thương hàn, nhiễm trựng
đường ruột ở người và động vật.
- Candida albicans: là nấm men, thường gõy bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và cỏc bệnh
phụ khoa.
Mụi trường nuụi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.
Mẫu được pha trong DMSO (Đimethyl sulfoxide) với cỏc nồng độ 128; 32; 8; 2; 0,5 àg/ml. Cỏc dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử. Sau đú lấy 10 àl dung dịch mẫu thử theo cỏc nồng độ đĩ được pha loĩng, thờm 200 àl dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ 37oC trong 24 giờ.
Giỏ trị IC50 được tớnh toỏn dựa trờn số liệu đo độ đục của mụi trường nuụi cấy bằng mỏy quang phổ TECAN (Genios) và phần mềm raw data.
30 2.2. TỔNG HỢP PHỐI TỬ VÀ PHỨC CHẤT
2.2.1. Tổng hợp cỏc phối tử Hthbz, Hpthbz
Mặc dự cú hai nhúm NH2 trong phõn tử nhưng ở điều kiện thường thiosemicacbazit chỉ ngưng tụ với 1 phõn tử hợp chất cacbonyl ở nhúm NH2- hiđrazin theo tỷ lệ mol là 1 : 1. Phản ứng này xảy ra định lượng [4]. Khi một nguyờn tử hiđro của nhúm NH2 - amit trong thiosemicacbazit bị thế bởi cỏc nhúm metyl hay phenyl... phản ứng ngưng tụ này càng chọn lọc hơn vỡ chỉ cũn một nhúm NH2-hiđrazin trong phõn tử. Cỏc thiosemicacbazon của p-đimetyl amino benzanđehit với thiosemicacbazit và cỏc dẫn xuất thế N(4) của thiosemicacbazit trong luận văn này được chỳng tụi tổng hợp theo tỷ lệ mol thiosemicacbazit : hợp chất cacbonyl = 1 : 1 theo sơ đồ chung dưới đõy, mụ phỏng theo cỏch tổng hợp cỏc thiosemicacbazon khỏc trong cỏc tài liệu [1], [9], [35].
Phản ứng ngưng tụ tạo thành cỏc thiosemicacbazon theo sơ đồ sau:
R: H, C6H5
Sơ đồ 2.1. Sơđồ chung tổng hợp cỏc phối tử thiosemicacbazon
Hồ tan 0,01 mol (0,91 g thiosemicacbazit hoặc 1,67 g N(4)-phenyl thiosemicacbazit) trong 30 ml nước đĩ được axit hoỏ bằng dung dịch HCl sao cho mụi trường cú pH bằng 1- 2. Sau đú, đổ từ từ dung dịch này vào 20 ml dung dịch
31
etanol đĩ hồ tan 0,01 mol benzanđehit (1 ml). Hỗn hợp này được khuấy trờn mỏy khuấy từ ở nhiệt độ phũng sẽ thấy xuất hiện kết tủa màu trắng. Tiếp tục khuấy thờm 2 giờ nữa ở nhiệt độ phũng để cho phản ứng xảy ra hồn tồn. Lọc kết tủa trờn phễu lọc đỏy thuỷ tinh xốp, rửa bằng nước, hỗn hợp etanol - nước và etanol. Sản phẩm được làm khụ trong bỡnh hỳt ẩm đến khối lượng khụng đổi để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo, hiệu suất tổng hợp đạt khoảng 90%
Kết quả tổng hợp cỏc phối tử và màu sắc, dung mụi hũa tan chỳng được trỡnh bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Cỏc hợp chất cacbonyl và thiosemicacbazon tương ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thiosemicacbazon tương ứng TT Hợp chất
thiosemicacbazit
Ký
hiệu Hiệu suất tổng hợp
Màu
sắc Dung mụi hồ tan 1 thiosemicacbazit Hthbz 90% trắng etanol, CHCl3, DMF, DMSO… 2 N(4) - phenyl thiosemicacbazit Hpthbz 90% trắng etanol, CHCl3, DMF, DMSO… 2.2.2. Tổng hợp cỏc phức chất
Như đĩ nờu ở phần tổng quan, tựy thuộc vào số nguyờn tử cho cú trong phõn tử mà thiosemicacbazon cú thể là phối tử hai càng hay ba càng. Thiosemicacbazon của benzanđehit khụng cú thờm nguyờn tử cho nào ở phần hợp chất cacbonyl nờn thường thể hiện dung lượng phối trớ là 2 với bộ nguyờn tử cho là N(1) và S [5], [9], [38]. Ion Zn2+, Cu2+ thường tạo thành phức chất với số phối trớ 4 với nhiều thiosemicacbazon khỏc nhau [19], [34], [42] nờn chỳng tụi đĩ tổng hợp phức chất theo tỷ lệ mol giữa ion kim loại và phối tử là 1 : 2. Cỏch tổng hợp được thực hiện
32
như sau, mụ phỏng theo cỏch tổng hợp một số phức thiosemicacbazon khỏc trong cỏc tài liệu [1], [9], [18], [40].
Cỏc phức chất của thiosemicacbazon với cỏc ion kim loại được tổng hợp theo sơ đồ chung sau đõy:
Sơđồ 2.2. Sơđồ chung tổng hợp cỏc phức chất của thiosemicacbazon với Zn(II) và Cu(II)
Hồ tan hồn tồn 4 mmol phối tử 0,716g Hthbz (1,020 g Hpthbz) trong 30 ml etanol núng rồi đổ từ từ vào dung dịch của 2 mmol muối MCl2 (10 ml, 0,2M) (M: Zn, Cu) đĩ được điều chỉnh mụi trường bằng NH3 đặc đến khi vừa đủ tạo thành phức amoniacat (pH: 9-10). Vừa đổ, vừa khuấy đều hỗn hợp trờn mỏy khuấy từ ở nhiệt độ phũng khi thấy xuất hiện kết tủa màu trắng của phức Zn(II) hoặc màu nõu nhạt của phức Cu(II) thỡ khuấy tiếp 2 giờ nữa. Lọc, rửa kết tủa trờn phễu lọc thuỷ tinh đỏy xốp bằng nước, hỗn hợp etanol - nước và etanol. Làm khụ chất rắn thu được trong bỡnh hỳt ẩm đến khối lượng khụng đổi để tiến hành nghiờn cứu phức chất với hiệu suất tổng hợp đạt khoảng 70%.
33
Kết quả tổng hợp, màu sắc và một số dung mụi hũa tan của 04 phức chất được trỡnh bày trờn Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Cỏc phức chất, màu sắc và một số dung mụi hũa tan chỳng
Phức chất của thiosemicacbazon TT Phối tử
Ký hiệu Hiệu suất
tổng hợp Màu sắc Dung mụi hồ tan Zn(thbz)2 75 % trắng DMF, DMSO… 1 Hthbz
Cu(thbz)2 70 % nõu nhạt DMF, DMSO… Zn(pthbz)2 75 % trắng DMF, DMSO… 2 Hpthbz
34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phõn tớch hàm lượng kim loại trong phức chất.
Sau khi tiến hành phõn tớch hàm lượng ion kim loại trong phức chất và tớnh toỏn lý thuyết theo cụng thức giả định chỳng tụi thu được kết quả và trỡnh bày trong Bảng 3.1 dưới đõy.
Bảng 3.1. Kết quả phõn tớch hàm lượng kim loại trong cỏc phức chất
Hàm lượng ion kim loại STT Phức chất LT(%) TN(%) Cụng thức phõn tử giả định M 1 Zn(thbz)2 15,44 15,69 ZnC16H16N6S2 420 2 Cu(thbz)2 14,79 15,04 CuC16H16N6S2 419 3 Zn(pthbz)2 11,19 11,24 ZnC28H24N6S2 572 4 Cu(pthbz)2 10,41 10,03 ZnC28H24N6S2 571
Kết quả tớnh toỏn hàm lượng của cỏc kim loại trong phức thức theo cụng thức giả định và theo thực nghiệm khỏ phự hợp nhau. Điều đú cho thấy cụng thức giả định của tất cả cỏc phức chất đưa ra là hợp lý. Để khẳng định cụng thức phõn tử của cỏc phức chất cũng như cụng thức cấu tạo của cỏc phức chất chỳng tụi tiếp tục nghiờn cứu phối tử và phức chất bằng cỏc phương phỏp húa lý hiện đại khỏc.
3.2. Phổ hồng ngoại của cỏc phối tử Hthbz, Hpthbz và cỏc phức chất của chỳng với Zn(II) và Cu(II). với Zn(II) và Cu(II).
Cấu tạo của benzanđehit và thiosemicacbazon benzanđehit với 2 dạng tồn tại được trỡnh bày dưới đõy:
benzanđehit Phối tử dạng thion Phối tử dạng thiol R: H, C6H5
Phổ hấp thụ hồng ngoại của cỏc phối tử Hthbz, Hpthbz và phức chất của chỳng với Zn(II) và Cu(II) được đưa ra trờn cỏc Hỡnh 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.
35 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hỡnh 3.1. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phối tử Hthbz
Hỡnh 3.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phức chất Zn(thbz)2
36
Hỡnh 3.4. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phối tử Hpthbz
Hỡnh 3.5. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phức chất Zn(pthbz)2
37
Phổ hồng ngoại của cỏc phối tử và phức chất tương ứng cú sự khỏc nhau rừ nột ở một số dải hấp thụ đặc trưng. Điều này chứng tỏ phức chất đĩ được hỡnh thành.
Một số dải hấp thụ chớnh trong phổ của cỏc phối tử và cỏc phức chất tương ứng với Zn(II) và Cu(II) được liệt kờ trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Một số dải hấp thụđặc trưng trong phổ hấp thụ hồng ngoại của cỏc phối tử Hthbz, Hpthbz và phức chất của chỳng với Zn(II), Cu(II) Dải hấp thụ (cm-1) Hợp chất ν(NH) ν(N(2)=C) ν(C=N(1)) ν(CNN) ν(NN) ν(C=S) Hthbz 3549, 3420, 3252 - 1540 1467 1060 870 Zn(thbz)2 3419, 3263, 3171 1591 1540 1379 1059 817 Cu(thbz)2 3394, 3344, 3069 1595 1491 1431 1050 756 Hpthbz 3304,3161 - 1592 1443 1060 941 Zn(pthbz)2 3484, 3329 1591 1503 1386 1045 834 Cu(pthbz)2 3330, 3062 1593 1493 1309 1050 753
Trờn phổ hồng ngoại của cả cỏc phối tử và cỏc phức chất đều xuất hiện dải hấp thụ rộng, đặc trưng cho dao động húa trị của nhúm NH trong vựng 3200 - 3400 cm-1. Tuy nhiờn, cú sự khỏc nhau về hỡnh dạng phổ và cường độ tương đối của cỏc dải trong phổ của phối tử và phức chất tương ứng. Mặt khỏc, trờn phổ hấp thụ hồng ngoại của cỏc phối tử Hthbz và Hpthbz thấy xuất hiện dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hoỏ trị của liờn kết C = S lần lượt ở 870 và 941 cm-1 nhưng khụng thấy xuất hiện dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hoỏ trị của liờn kết SH ở vựng 2570 cm-1. Điều này cho thấy phối tử tự do tồn tại ở trạng thỏi thion và bị thiol húa khi chuyển vào phức chất tương ứng. Bằng chứng là sự thay đổi dải dao động húa trị của nhúm NH và trờn phổ hồng ngoại của cỏc phức chất đều thấy xuất hiện dải dao động húa trị đặc trưng cho nhúm N = C ở 1591 cm-1 trong phức chất Zn(thbz)2, ở 1595 cm-1
38
trong phức chất Cu(thbz)2 ở 1591 cm-1, trong phức chất Zn(pthbz)2 và ở 1593 cm-1 trong phức chất Cu(pthbz)2.
Trờn phổ hồng ngoại của cỏc phức chất cũng khụng thấy xuất hiện dải dao động húa trị đặc trưng cho nhúm SH, điều này cho thấy phức chất đĩ được hỡnh thành qua liờn kết phối trớ với nguyờn tử S. Bằng chứng là sự chuyển dịch về số súng thấp hơn của dao động húa trị nhúm CS. Dải dao động này xuất hiện ở 817, 756 cm-1 lần lượt trong phổ của cỏc phức chất Zn(thbz)2, Cu(thbz)2 và ở 834, 753 cm-1 lần lượt trong phổ của cỏc phức chất Zn(pthbz)2, Cu(pthbz)2.
Cỏc dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hoỏ trị của liờn kết C=N(1) ở 1540 và 1592 cm-1 tương ứng trong cỏc phối tử Hthbz và Hpthbz đều bị giảm cường độ và dịch chuyển về số súng thấp hơn trong phổ của phức chất tương ứng, dải này xuất hiện ở 1540, 1491, 1503 và 1493 cm-1 tương ứng trong cỏc phức chất Zn(thbz)2, Cu(thbz)2, Zn(pthbz)2 và Cu(pthbz)2. Bằng chứng này cho thấy nguyờn tử N(1) đĩ tham gia tạo liờn kết phối trớ với ion kim loại trung tõm. Điều này được giải thớch là do tạo liờn kết phối trớ giữa N(1) với ion kim loại trung tõm và sự thiol hoỏ phần khung thiosemicacbazon mật độ electron trờn nhúm CN(1) giảm.
Bằng chứng khỏc cho phộp khẳng định liờn kết được hỡnh thành qua nguyờn