chằng nha chu
Chia nhóm nghiên cứu thành 4 nhóm:
• Nhóm 1: vật liệu Biodentine
• Nhóm 2: vật liệu Amalgam
• Nhóm đối chứng dương: DMSO (Dimethyl sulfoxide)
Mỗi nhóm nghiên cứu sẽ được thực hiện thí nghiệm trên 3 giếng và lặp lại 3 lần. Ngâm khối vật liệu Biodentine (nhóm 1), Amalgam (nhóm 2) trong môi trường DMEM/F12 với tỉ lệ 0,2 g/1 ml môi trường sau 1 ngày để thu dịch chiết.
Tế bào đa năng dây chằng nha chu thế hệ thứ 4 được nuôi trong đĩa 4 giếng đạt mật độ 80% (khoảng 5 ngày). Thay môi trường DMEM bằng dịch chiết vật liệu Biodentine (nhóm 1), Amalgam (nhóm 2), DMSO trong môi trường (nhóm đối chứng dương), không có vật liệu (nhóm đối chứng âm) và quan sát tế bào trước và sau 24 giờ.
Dựa vào tiêu chuẩn ISO 10993-5, vật liệu sẽ được ngâm trong môi trường nuôi cấy để thu nhận dịch chiết và sử dụng dịch chiết đó để nuôi cấy tế bào. Sau 24 nuôi cấy, dựa vào hình dạng tế bào xác định mức độ gây độc 0, 1, 2, 3, 4 của dịch chiết (dựa vào bảng 1.2).
Bảng 1.2: Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm dịch chiết
Mức độ Phản ứng Tình trạng của đĩa nuôi
0 Không Các hạt trong bào tương riêng rẽ, không có sự ly giải tế bào.
1 Rất nhẹ
Không quá 20% tế bào ở dạng tròn, bám dính lỏng lẻo và không có hạt trong bào tương, thỉnh thoảng xuất hiện các tế bào ly giải.
2 Nhẹ
Không quá 50% tế bào ở dạng tròn và không có hạt trong bào tương, không có sự ly giải tế bào lan rộng và vùng trống giữa các tế bào.
3 Vừa Không quá 70% lớp đơn tế bào chứa tế bào dạng tròn hoặc bị ly giải. 4 Nghiêm trọng Lớp đơn tế bào gần như bị phá huỷ hoàn toàn.
2.2.3.4 Phương pháp đánh giá tăng sinh tế bào trên bề mặt vật liệu
Dung dịch MTT là một loại tetrazole có màu vàng. MTT được chuyển hóa thành tinh thể formazan màu tím trong tế bào sống dưới tác dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể. Số lượng tế bào càng lớn sẽ tạo ra một lượng formazan càng lớn, do đó làm tăng mật độ quang. Phương pháp này giúp ta đánh giá được số tế bào còn sống hoặc khả năng tăng trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát. Phương pháp MTT cho kết quả tương đối chính xác, đơn giản, an toàn hơn phương pháp đo độ hấp thu phóng xạ, đặc hiệu cho khả năng biến dưỡng ở tế bào sống, có khả năng đo được số lượng mẫu lớn, đặc biệt ở cả những mẫu có cấu trúc 3 chiều.
Hình 2.3: Nguyên tắc phương pháp MTT
Tiến hành
- Tế bào đa năng dây chằng nha chu thế hệ thứ 4 được nuôi trong đĩa 4 giếng, khi đạt mật độ 80% (khoảng 5 ngày) thì tiến hành khảo sát.
- Tiến hành khảo sát MTT trên nhóm vật liệu có mức độ độc tính ≤ 2:
• Nhóm 1: Bỏ khối vật liệu Biodentinevào đĩa 4 giếng có phủ agar xung quanh khối vật liệu trong giếng. Đưa tế bào lên bề mặt khối vật liệu với mật độ 5 x 104 tế bào/khối.
• Nhóm 2: Bỏ khối vật liệuAmalgamvào đĩa 4 giếng có phủ agar xung quanh khối vật liệu trong giếng.Đưa tế bào lên bề mặt khối vật liệu với mật độ 5 x 104
tế bào/khối.
• Nhóm đối chứng âm: Tế bào nuôi trong DMEM/F12 bình thường - Khảo sát MTT ở 5 thời điểm.
- Cho vào mỗi giếng 90 µl môi trường mới + 10 µl dung dịch MTT 5mg/ml. Trộn đều dung dịch. Ủ qua đêm trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
- Tiến hành đo mật độ quang OD ở bước sóng 490 nm bằng máy đo OD sau khi hút bỏ toàn bộ dịch trong các giếng. Sử dụng phần mềm Multimode Alysis để phân tích và ghi nhận kết quả nhằm xác định mật độ quang sau mỗi 1, 3, 5, 7, 9 ngày.
- Sau đó, xây dựng và khảo sát đường cong tăng trưởng.
2.2.3.5 Phương pháp đánh giá hình thái tế bào trên khối vật liệu bằng cách chụp ảnh SEM
Các khối vật liệu được gửi đi chụp SEM tại Viện công nghệ sinh học Việt Nam nhằm đánh giá hình thái tế bào trên khối vật liệu.
• Nhóm 1: khối vật liệu Biodentine được cấy tế bào đa năng dây chằng nha chu sau 3 ngày.
• Nhóm 2: khối vật liệu Amalgam được cấy tế bào đa năng dây chằng nha chu sau 3 ngày.
• Nhóm đối chứng âm: tế bào đa năng dây chằng nha chu bám trên bề mặt đĩa nuôi sau 3 ngày.
Tiêu chuẩn đánh giá:
• Tế bào bám dính tốt: dạng phẳng, trải trên bề mặt vật liệu có dạng tương tự như quả trứng chiên mà nhân là lòng đỏ.
• Tế bào bám dính kém: dạng tròn (thu hẹp diện tích màng sinh chất để tiết kiệm năng lượng).
Hình 2.4: Sơ đồ minh hoạ tế bào bám trải trên bề mặt vật liệu. Tế bào thần kinh (A). Tế bào biểu mô (B). Tế bào mô liên kết (C) [4]
2.2.4 Các biến nghiên cứu
2.2.4.1 Biến độc lập: • Biodentine • Amalgam 2.2.4.2 Biến phụ thuộc: • Độc tính: biến định tính (thứ tự), gồm 5 mức độ: 0 1 2 3 4
Không Rất nhẹ Nhẹ Vừa Nghiêm trọng
• Sự tăng sinh: biến định lượng
Đo mật độ quang OD ở bước sóng 490 nm sau mỗi 1, 3, 5, 7, 9 ngày. Giá trị trung bình mật độ quang càng cao, tế bào tăng sinh càng nhiều ở thời điểm khảo sát và ngược lại.
• Hình thái tế bào:biến định tính
Mẫu vật liệu được cấy tế bào đa năng dây chằng nha chu sau 3 ngày được gửi đi chụp SEM:
o Tế bào dạng phẳng: bám dính tốt trên bề mặt vật liệu.
Tế bào đa năng dây chằng nha chu (P3) (Nguồn có sẵn trong Lab-KHTN)
Cấy chuyền tế bào từ P3P4
Đánh giá độc tínhin vitro của vật liệu qua dịch chiết sau 24 giờĐánh giá sự tăng sinh của tế bào trên khối vật liệu sau 1, 3, 5, 7, 9 ngày vật liệu trên
Đánh giá hình thái của tế bào trên bề mặt khối vật liệu sau 3 ngày bằng SEM Vật liệu
Biodentine
(Nhóm 1)
Amalgam
(Nhóm 2)
Tạo khối (giá thể)
2.2.5 Thu thập, xử lý và phân tích số liệu
Số liệu sau khi thu nhận được nhập vào máy vi tính và được xử lý bằng phần mềm thống kê Stata phiên bản 12.
• Thống kê mô tả:
Tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ tin cậy ở mức xác suất p =95%.
• Thống kê suy lý:
Sử dụng test ANOVA so sánh mật độ quang của tế bào tăng sinh giữa các thời điểm (5 thời điểm) trong cùng 1 loại vật liệu và giữa 2 loại vật liệu Biodentine và Amalgam.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ DỰ KIẾN:
3.1 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH IN VITRO CỦA VẬT LIỆU ĐỐI VỚI TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU
Bảng 3.5: Mức độ độc tính sau 24 giờ theo tiêu chuẩn ISO 10993 Mức độ độc sau 24 giờ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Biodentine Amalga m
Biodentine Amalgam Biodentine Amalgam
3.2 ĐÁNH GIÁ TĂNG
SINH TẾ BÀO TRÊN BỀ MẶT VẬT LIỆU
Bảng 3.6: Giá trị trung bình mật độ quang ở bước sóng 450 nm
Thời điểm (Ngày)
Giá trị trung bình mật độ quang OD
Biodentine Amalgam 1 3 5 7 9
3.3 ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI TẾ BÀO TRÊN KHỐI VẬT LIỆU BẰNG CÁCH CHỤP ẢNH SEM
LỢI ÍCH CỦA ĐỀ TÀI
1. Nghiên cứu cung cấp những chứng cứ khoa học về hiệu quả của vật liệu Calcium silicate (Biodentine) trên tế bào dây chằng nha chu.
2. Giúp hiểu rõ hơn về tính tương hợp sinh học của vật liệu Calcium silicate (Biodentine) trên sự lành thương mô nha chu.
3. Trên lâm sàng: gợi ý cho các bác sĩ chọn lựa vật liệu trám ngược trong phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược.
ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu sử dụng nguồn tế bào đa năng dây chằng nha chu người thế hệ 3 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Bộ môn sinh lý học và công nghệ sinh học động vật thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh(tế bào đa năng dây chằng nha chu người được lấy từ răng người khoẻ mạnh được chỉ định nhổ bởi lý do chỉnh nha và được hội đồng y đức của Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh thông qua).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Hoàng Tử Hùng (2001),Mô phôi răng miệng, Nhà xuất bản y học, tr.219-239. 2. Nguyễn Thị Thu Hảo (2013),Nuôi cấy và nhận diện tế bào gốc nhú chóp răng
người, Luận văn cử nhân khoa học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
3. Phan Kim Ngọc (2009),Công nghệ tế bào gốc, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, tr.30-31, 178-192, 361.
4. Trần Lê Bảo Hà, Tô Minh Quân, Đoàn Nguyên Vũ (2012),Công nghệ vật liệu sinh học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, tái bản lần thứ nhất, tr.128-139.
Tài liệu tiếng Anh:
5. Andreasen JO, Jorgen Rud (1972), Modes of healing histologically after endodontic surgery in 70 cases, Int. J. oral Surg, 1, pp.148-160.
6. Andreasen JO(1973), Cementum repair after apicoectorny in humans, Acta Odont Scand, 31,pp.211-21.
7. Andreasen JO (2011), Pulp and periodontal tissue repair - regeneration or tissue metaplasia after dental trauma. A review, Dental Traumatology.
8. Andriara De Rossi, Lea Assed Bezerra Silva, Patricia Gaton-Hernandez, Manoel Damiao Sousa-Neto, Paulo Nelson-Filho, Raquel Ased Bezerra Silva, Alexandra Mussolino de Queiroz (2014), Comparison of pupal responses to pulpotomy and pulp capping with Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate in dogs, Basic research biology, JOE.
9. Bartold PM, Shi S, Gronthos S (2006), Stem cells and periodontal regeneration, Periodontal, 40, pp.164-172.
10. Boyko G. A., Melcher A. H., Brunette D. M (1981), Formation of new periodontal ligament by periodontal ligament cells implanted in vivo after
culture in vitro. A preliminary study of transplanted roots in the dog, Journal of Periodontal Research, 16, pp.73-88.
11. Camila M. Corral Nunez, Helen J. Bosomworth, Claire Field, John M. Whitworth, Ruth A. Valentine (2014), Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate induce similar cellular responses in a fibroblast cell line, Basic research biology, JOE, 40(3).
12. Camilleri J, Piit Ford TR (2006), Mineral Trioxide Aggregate: a review of the constituents ang biological properties of th material, International Endodontic Journal, 39(10), pp.747-54.
13. Feng F, Akiyama K, Liu Y, Yamaza T, Wang TM, Chen JH, Wang BB, Huang GT, Wang S, Shi S (2010), Utility of PDL progenitors for in vivo tissue regeneration: a report of 3 cases, Oral Dis, 16, pp.8-20.
14. Gould T., Melcher A., and Brunette D. (1980), Migration and Division of Progenitor Cell Populations in Periodontal Ligament After Wounding, J Periodont Res, 15,pp.20-42.
15. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S (2000), Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci, 97, pp.13625-13630.
16. Ha Le Bao Tran, Vu Nguyen Doan, Huong Thi Ngoc Le, Lan Thi Quynh Ngo (2014), Various methods for isolationof multipotent human periodontal ligament cells for regenerative medicine, In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, Springer, 50(7), pp.597-602.
17. Hanan A. Balto (2004), Attachment and Morphological Behavior of Human Periodontal Ligament Fibroblasts to Mineral Trioxide Aggregate: A Scanning Electron Microscope Study, Journal of endodontics,30(1).
18. Harrison JW, Jurosky KA (1991), Wound healing in the tissues of the periodon- tium following periradicular surgery. The osseous excisional wound, J Endodon, 18, pp.76-81.
19. Huang GT, Gronthos S, Shi S (2009), Mechenchymal stem cells derived from dental tissue vs those from other sources: their biology ang role in regenerative medicine. J Dent Res, 88, pp.792-796.
20. Isidor F., Karring T., Nyman S., Lindhe J. (1986), The Significance of Coronal Growth of Periodontal Ligament Tissue for New Attachment Formation, J Clin Periodontol, 13,pp.145-150.
21. Karl Keiser, C. Chad Johnson, David A. Tipton (2000), Cytotoxicity of Mineral Trioxide Aggregate Using Human Periodontal Ligament Fibroblasts,
Journal of endodontics, 26(5).
22. Laurent P, Jean Camps, Michel De Méo, Jacques Déjou, Imad About (2008),
Indution of specific cell responses to a Ca3SiO5-based posterior restorative material, Dental materials, Elsevier.
23. Lee BN, Hwang Yc, Jang JH, Chang HS, Hwang IN, Yang SY (2011),
Improvement of the properties of Mineral Trioxide Aggregate by mixing with hydration accelerators, Journal of endodontics, 37(10), pp.1433-6.
24. Marjorie Zanini, Jean Michel Sautier, Ariane Berdal, Stéphane Simon, (2012),
Biodentine induces immortalized murine pulp cell differentiation into odontoblast-like cells and stimulates biomineralization, Basic research biology, JOE, 38(9).
25. Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Fisher LW, Robey PG, Shi S (2003),
SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth, Proc Natl Acad Sci,100(10), pp.5807-12.
26. Morsczeck C, Götz W, Schierholz J, Zeilhofer F, Kühn U, Möhl C, Sippel C, Hoffmann KH (2005), Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth, Matrix Biol,24(2), pp.155-65.
27. Nyman S., Lindhe J., Karring T., Rylander H. (1982), New Attachment Following Surgical Treatment of Humran Periodontal Disease, J Clin Periodontol, 9, pp.290-296.
28. Robert HW, Toth JM, Berzins DW, Charton DG (2008), Mineral Trioxide Aggregate use in endodontic treament: a review of the literature, Dental materials, 24(2), pp.149-64.
29. Seo BM, Miura M, Gronthos S, Bartold PM, Batouli S, Brahim J, Young M, Robey PG, Wang CY, Shi S (2004), Investigationof multipotent postnatalstem cells from human periodontal ligament, Lancet, 364, pp.149-155.
30. Somerman M.J., Archer' S.Y, Imm G.R., Foster R.A. (1988), A Comparative Study of Human Periodontal Ligament Cells and Gingival Fibroblasts in vitro,
J Dent Res, 67(1), pp.66-70.
31. Sonoyama W, Liu Y, Fang D, et al (2006), Mesenchymal stem cellmediated functional tooth regeneration in Swine, Plos One, 1, pp.79.
32. Sonoyama W, Liu Y, Yamaza T, et al (2008), Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study, J Endod, 34:166-171.
33. Torabinejad M, Watson TF, Pitt Ford TR (1993), Sealing ability of a mineral trioxide aggregate when used as a root end filling material, J Endodon, 19, pp.591-5.
34. Torabinejad M, Rastegar AF, Kettering JD, Pitt Ford TR (1995),Bacterial leakage of mineral trioxide aggregate as a root-end filling material, J Endodon,21, pp.109-12.
35. Torabinejad M, Hong CU, Lee SJ, Monsef M, Pitt Ford TR (1995),Investiga- tion of mineral trioxide aggregate for root-end filling in dogs, J Endodon,21, pp.603-8.
36. Torabinejad M. Hong CU, Pitt Ford TR, Kettering JD (1995),Cytotoxicity of four root end filling materials, J Endodon, 2, pp.489-92.
37. Wada N Menicain D, Shi S, Bartold PM, Gronthos S (2009),
Immunomodulatory properties of human ligament stem cells, J Cell Physiol, 219, pp.667-676.
38. Willershausen I., Wolf T., Kasaj A., Weyer V., Willershausen B., Benjamin Briseno Marroquin (2013), Influence of a bioceramic root end material and
mineral trioxide aggregates on fibroblasts and osteoblasts, Archives of oral biology, Elsevier.