Bảng 2.4: Một số dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
ST
T Tên dụng cụ
Tên thiết bị
1 Ống falcon (15 ml, 50 ml) Tủ nuôi cấy tế bào (Sanyo) 2 Bình Roux 25 cm2 Tủ thao tác vô trùng (Nuaire) 3 Đĩa 4 giếng đường kính 10 mm/giếng Tủ ủ ấm môi trường (Sanyo)
4 Micropipettte 10-100 µl, 100-1000 µl Kính hiển vi đảo ngược (Narishage) 5 Đầu tip 100 µl, 1000 µl Máy ly tâm (Hettich)
6 Eppendorf 1.5 ml Máy lắc (Stuart)
7 Buồng đếm hồng cầu Tủ lạnh chứa hoá chất (Sanyo)
8 Nồi hấp khử trùng (Daihan)
2.2.2.2 Hóa chất
• Môi trường nuôi sơ cấp tế bào - DMEM/F12 thương mại (Sigma)
- FBS (Fetal bovine serum- Huyết thanh bào thai bò): 10% - L-glutamin2 mM
• Hoá chất gây độc tế bào
DMSO (Dimethyl sulfoxide)
• Các hoá chất khác
MTT 5 mg/ml
Trypsin - EDTA 0,25%
Dung dịch PBS (phosphate-buffered saline) 10X thương mại (Gibco) Thuốc nhuộm Trypan blue
2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu
2.2.3.1 Cấy chuyền và xác định số lượng tế bào
Nguồn tế bào đa năng dây chằng nha chu người thế hệ tế bào P3 được cấy chuyền đến thế hệ tế bào P4 (các tế bào đạt độ đồng nhất về hình dạng) để chuẩn bị thử nghiệm đánh giá độc tính của vật liệu lên tế bào và tăng sinh của tế bào trên vật liệu. Theo dõi sự tăng sinh của các tế bào đến khi chúng trải thành một lớp đơn phủ kín trên bề mặt dụng cụ nuôi (độ bao phủ đạt gần 85%). Lúc này tiến hành cấy chuyền sang dụng cụ nuôi mới cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh và phát triển.
• Cấy chuyền từ bình Roux sang bình Roux
- Đổ bỏ môi trường nuôi cấy cũ.
- Rửa bề mặt giá thể nuôi với 2 ml PBS (rửa 2 lần), hút bỏ hết PBS ở lần cuối. - Hút vào 1 ml trypsin-EDTA 0.25%; ủ trong tủ ấm 370C trong khoảng 1-2 phút để tế bào tách khỏi bề mặt bình nuôi.
- Huyền phù với 1 ml môi trường có bổ sung huyết thanh để bất hoạt trypsin. - Chuẩn bị 2-3 bình Roux mới (tùy tỉ lệ cấy chuyền); cho vào mỗi bình 2 ml môi trường nuôi cấy mới và lượng huyền phù tế bào chia đều cho mỗi bình. - Nuôi trong tủ ấm ở 370C, 5% CO2.
- Thay môi trường 2 ngày một lần.
• Phương pháp xác định số lượng tế bào
Dùng thuốc nhuộm trypan blue để phân biệt tế bào sống và chết trên buồng đếm Neubauer dựa vào tính thấm của trypan blue đối với các tế bào chết (màng tế bào chết mất tính thấm chọn lọc nên trypan blue sẽ thấm qua được).
Trypan blue có màu xanh dương. Vì vậy, khi hòa trộn dịch huyền phù tế bào với trypan blue, những tế bào sống không bắt màu, kích thước nhỏ, tròn và sáng. Những tế bào chết sẽ bắt màu xanh đen.
Tiến hành
- Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ trong Roux. - Rửa 2 lần với PBS (2 ml/lần). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tách tế bào trong giếng đó bằng 500 μl trypsin – EDTA 0.25%; ủ trong 1 phút.
- Bổ sung 500 μl môi trường nuôi cấy để bất hoạt trypsin.
- Cho dung dịch vào ống falcon 15, sau đó đem ly tâm (3000 vòng trong 5 phút) để thu cặn tế bào.
- Bổ sung 1000 µl môi trường nuôi cấy thu được huyền phù tế bào. Hút 10 µl đem đi đếm.
- Pha loãng tỉ lệ 1:4 huyền phù với 0.4% trypan blue. - Trộn mẫu bằng pipette man.
- Phủ buồng đếm với lamelle và cho một giọt huyền phù tế bào vào buồng đếm bằng cách nhỏ sát chỗ tiếp xúc giữa cạnh lamelle và buồng đếm. Nhờ hệ thống mao dẫn mà giọt huyền phù sẽ tràn đầy buồng đếm.
- Chỉnh kính hiển vi quang học ở vật kính 4X, định vị buồng đếm trên thị trường. Đếm tế bào ở vật kính 10X.
- Đếm 5 vùng đếm: 4 vùng ở 4 góc và 1 vùng ở giữa.
- Đếm tất cả tế bào không bắt màu với thuốc nhuộm (tế bào sống) và những tế bào bắt màu xanh (tế bào chết). Đếm theo nguyên tắc cạnh trên - bên phải (đối với những tế bào nằm ở vạch ranh giới, đếm các tế bào nằm bên trên và bên phải của ô đang đếm, không đếm các tế bào nằm bên dưới và bên trái).
- Đếm 3 mẫu rồi lấy số tế bào trung bình là A. Thành lập công thức tính mật độ tế bào.
Hình 2.2: Buồng đếm tế bào
- Trong mỗi buồng đếm có 9 vùng đếm tương ứng với 9 ô vuông. Chỉ có vùng đếm ở giữa là có 25 ô lớn, mỗi ô lớn chia thành 16 ô nhỏ. Vậy vùng đếm ở giữa có tổng cộng là: 25 x 16 = 400 ô nhỏ.
- Thể tích một ô nhỏ là: 1/20 x 1/20 x 1/10 =1/4000 mm3 (chiều cao là 1/10 mm).
- Thể tích của vùng đếm ở giữa là: 400 x 1/4000 = 1/10 mm3 hay 10-4 ml. - Số tế bào trong 1 ml môi trường là: (A/5)/ 10-4 = (A/5) x 104 (tế bào/ml). - Nhưng vì trong khi nhuộm, thể tích mẫu được trộn với trypan blue theo tỉ lệ 1:4 nên mẫu được pha loãng ra 5 lần. Vậy số lượng tế bào trong 1 ml huyền phù (N) là: N = (A/5) x 104 x 5 (tế bào/ml).
2.2.3.2 Chuẩn bị vật liệu tạo giá thể
Biodentine (nhóm 1), Amalgam (nhóm 2) dạng con nhộng được trộn trên máy trộn thành hỗn hợp đồng nhất. Sau đó,hỗn hợp được lấy ra bỏ vào khuôn đã được hấp vô trùng để tạo dạng khối thống nhất và đợi vật liệu đông cứng (mô phỏng lâm sàng): 6 phút đối với Biodentine và 4 phút đối với Amalgam.
2.2.3.3 Phương pháp đánh giá độc tính in vitro của vật liệu đối với tế bào dâychằng nha chu chằng nha chu
Chia nhóm nghiên cứu thành 4 nhóm:
• Nhóm 1: vật liệu Biodentine
• Nhóm 2: vật liệu Amalgam
• Nhóm đối chứng dương: DMSO (Dimethyl sulfoxide)
Mỗi nhóm nghiên cứu sẽ được thực hiện thí nghiệm trên 3 giếng và lặp lại 3 lần. Ngâm khối vật liệu Biodentine (nhóm 1), Amalgam (nhóm 2) trong môi trường DMEM/F12 với tỉ lệ 0,2 g/1 ml môi trường sau 1 ngày để thu dịch chiết.
Tế bào đa năng dây chằng nha chu thế hệ thứ 4 được nuôi trong đĩa 4 giếng đạt mật độ 80% (khoảng 5 ngày). Thay môi trường DMEM bằng dịch chiết vật liệu Biodentine (nhóm 1), Amalgam (nhóm 2), DMSO trong môi trường (nhóm đối chứng dương), không có vật liệu (nhóm đối chứng âm) và quan sát tế bào trước và sau 24 giờ.
Dựa vào tiêu chuẩn ISO 10993-5, vật liệu sẽ được ngâm trong môi trường nuôi cấy để thu nhận dịch chiết và sử dụng dịch chiết đó để nuôi cấy tế bào. Sau 24 nuôi cấy, dựa vào hình dạng tế bào xác định mức độ gây độc 0, 1, 2, 3, 4 của dịch chiết (dựa vào bảng 1.2).
Bảng 1.2: Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm dịch chiết
Mức độ Phản ứng Tình trạng của đĩa nuôi
0 Không Các hạt trong bào tương riêng rẽ, không có sự ly giải tế bào.
1 Rất nhẹ
Không quá 20% tế bào ở dạng tròn, bám dính lỏng lẻo và không có hạt trong bào tương, thỉnh thoảng xuất hiện các tế bào ly giải.
2 Nhẹ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Không quá 50% tế bào ở dạng tròn và không có hạt trong bào tương, không có sự ly giải tế bào lan rộng và vùng trống giữa các tế bào.
3 Vừa Không quá 70% lớp đơn tế bào chứa tế bào dạng tròn hoặc bị ly giải. 4 Nghiêm trọng Lớp đơn tế bào gần như bị phá huỷ hoàn toàn.
2.2.3.4 Phương pháp đánh giá tăng sinh tế bào trên bề mặt vật liệu
Dung dịch MTT là một loại tetrazole có màu vàng. MTT được chuyển hóa thành tinh thể formazan màu tím trong tế bào sống dưới tác dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể. Số lượng tế bào càng lớn sẽ tạo ra một lượng formazan càng lớn, do đó làm tăng mật độ quang. Phương pháp này giúp ta đánh giá được số tế bào còn sống hoặc khả năng tăng trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát. Phương pháp MTT cho kết quả tương đối chính xác, đơn giản, an toàn hơn phương pháp đo độ hấp thu phóng xạ, đặc hiệu cho khả năng biến dưỡng ở tế bào sống, có khả năng đo được số lượng mẫu lớn, đặc biệt ở cả những mẫu có cấu trúc 3 chiều.
Hình 2.3: Nguyên tắc phương pháp MTT
Tiến hành
- Tế bào đa năng dây chằng nha chu thế hệ thứ 4 được nuôi trong đĩa 4 giếng, khi đạt mật độ 80% (khoảng 5 ngày) thì tiến hành khảo sát.
- Tiến hành khảo sát MTT trên nhóm vật liệu có mức độ độc tính ≤ 2:
• Nhóm 1: Bỏ khối vật liệu Biodentinevào đĩa 4 giếng có phủ agar xung quanh khối vật liệu trong giếng. Đưa tế bào lên bề mặt khối vật liệu với mật độ 5 x 104 tế bào/khối.
• Nhóm 2: Bỏ khối vật liệuAmalgamvào đĩa 4 giếng có phủ agar xung quanh khối vật liệu trong giếng.Đưa tế bào lên bề mặt khối vật liệu với mật độ 5 x 104
tế bào/khối.
• Nhóm đối chứng âm: Tế bào nuôi trong DMEM/F12 bình thường - Khảo sát MTT ở 5 thời điểm.
- Cho vào mỗi giếng 90 µl môi trường mới + 10 µl dung dịch MTT 5mg/ml. Trộn đều dung dịch. Ủ qua đêm trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
- Tiến hành đo mật độ quang OD ở bước sóng 490 nm bằng máy đo OD sau khi hút bỏ toàn bộ dịch trong các giếng. Sử dụng phần mềm Multimode Alysis để phân tích và ghi nhận kết quả nhằm xác định mật độ quang sau mỗi 1, 3, 5, 7, 9 ngày.
- Sau đó, xây dựng và khảo sát đường cong tăng trưởng.
2.2.3.5 Phương pháp đánh giá hình thái tế bào trên khối vật liệu bằng cách chụp ảnh SEM
Các khối vật liệu được gửi đi chụp SEM tại Viện công nghệ sinh học Việt Nam nhằm đánh giá hình thái tế bào trên khối vật liệu.
• Nhóm 1: khối vật liệu Biodentine được cấy tế bào đa năng dây chằng nha chu sau 3 ngày.
• Nhóm 2: khối vật liệu Amalgam được cấy tế bào đa năng dây chằng nha chu sau 3 ngày.
• Nhóm đối chứng âm: tế bào đa năng dây chằng nha chu bám trên bề mặt đĩa nuôi sau 3 ngày.
Tiêu chuẩn đánh giá:
• Tế bào bám dính tốt: dạng phẳng, trải trên bề mặt vật liệu có dạng tương tự như quả trứng chiên mà nhân là lòng đỏ.
• Tế bào bám dính kém: dạng tròn (thu hẹp diện tích màng sinh chất để tiết kiệm năng lượng).
Hình 2.4: Sơ đồ minh hoạ tế bào bám trải trên bề mặt vật liệu. Tế bào thần kinh (A). Tế bào biểu mô (B). Tế bào mô liên kết (C) [4]
2.2.4 Các biến nghiên cứu
2.2.4.1 Biến độc lập: • Biodentine • Amalgam 2.2.4.2 Biến phụ thuộc: • Độc tính: biến định tính (thứ tự), gồm 5 mức độ: 0 1 2 3 4
Không Rất nhẹ Nhẹ Vừa Nghiêm trọng
• Sự tăng sinh: biến định lượng
Đo mật độ quang OD ở bước sóng 490 nm sau mỗi 1, 3, 5, 7, 9 ngày. Giá trị trung bình mật độ quang càng cao, tế bào tăng sinh càng nhiều ở thời điểm khảo sát và ngược lại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Hình thái tế bào:biến định tính
Mẫu vật liệu được cấy tế bào đa năng dây chằng nha chu sau 3 ngày được gửi đi chụp SEM:
o Tế bào dạng phẳng: bám dính tốt trên bề mặt vật liệu.
Tế bào đa năng dây chằng nha chu (P3) (Nguồn có sẵn trong Lab-KHTN)
Cấy chuyền tế bào từ P3P4
Đánh giá độc tínhin vitro của vật liệu qua dịch chiết sau 24 giờĐánh giá sự tăng sinh của tế bào trên khối vật liệu sau 1, 3, 5, 7, 9 ngày vật liệu trên
Đánh giá hình thái của tế bào trên bề mặt khối vật liệu sau 3 ngày bằng SEM Vật liệu
Biodentine
(Nhóm 1)
Amalgam
(Nhóm 2)
Tạo khối (giá thể)
2.2.5 Thu thập, xử lý và phân tích số liệu
Số liệu sau khi thu nhận được nhập vào máy vi tính và được xử lý bằng phần mềm thống kê Stata phiên bản 12.
• Thống kê mô tả:
Tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ tin cậy ở mức xác suất p =95%.
• Thống kê suy lý:
Sử dụng test ANOVA so sánh mật độ quang của tế bào tăng sinh giữa các thời điểm (5 thời điểm) trong cùng 1 loại vật liệu và giữa 2 loại vật liệu Biodentine và Amalgam.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ DỰ KIẾN:
3.1 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH IN VITRO CỦA VẬT LIỆU ĐỐI VỚI TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU
Bảng 3.5: Mức độ độc tính sau 24 giờ theo tiêu chuẩn ISO 10993 Mức độ độc sau 24 giờ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Biodentine Amalga m
Biodentine Amalgam Biodentine Amalgam
3.2 ĐÁNH GIÁ TĂNG
SINH TẾ BÀO TRÊN BỀ MẶT VẬT LIỆU
Bảng 3.6: Giá trị trung bình mật độ quang ở bước sóng 450 nm
Thời điểm (Ngày)
Giá trị trung bình mật độ quang OD
Biodentine Amalgam 1 3 5 7 9
3.3 ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI TẾ BÀO TRÊN KHỐI VẬT LIỆU BẰNG CÁCH CHỤP ẢNH SEM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
LỢI ÍCH CỦA ĐỀ TÀI
1. Nghiên cứu cung cấp những chứng cứ khoa học về hiệu quả của vật liệu Calcium silicate (Biodentine) trên tế bào dây chằng nha chu.
2. Giúp hiểu rõ hơn về tính tương hợp sinh học của vật liệu Calcium silicate (Biodentine) trên sự lành thương mô nha chu.
3. Trên lâm sàng: gợi ý cho các bác sĩ chọn lựa vật liệu trám ngược trong phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược.
ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu sử dụng nguồn tế bào đa năng dây chằng nha chu người thế hệ 3 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Bộ môn sinh lý học và công nghệ sinh học động vật thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh(tế bào đa năng dây chằng nha chu người được lấy từ răng người khoẻ mạnh được chỉ định nhổ bởi lý do chỉnh nha và được hội đồng y đức của Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh thông qua).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Hoàng Tử Hùng (2001),Mô phôi răng miệng, Nhà xuất bản y học, tr.219-239. 2. Nguyễn Thị Thu Hảo (2013),Nuôi cấy và nhận diện tế bào gốc nhú chóp răng
người, Luận văn cử nhân khoa học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
3. Phan Kim Ngọc (2009),Công nghệ tế bào gốc, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, tr.30-31, 178-192, 361.
4. Trần Lê Bảo Hà, Tô Minh Quân, Đoàn Nguyên Vũ (2012),Công nghệ vật liệu sinh học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, tái bản lần thứ nhất, tr.128-139.
Tài liệu tiếng Anh:
5. Andreasen JO, Jorgen Rud (1972), Modes of healing histologically after endodontic surgery in 70 cases, Int. J. oral Surg, 1, pp.148-160.
6. Andreasen JO(1973), Cementum repair after apicoectorny in humans, Acta Odont Scand, 31,pp.211-21.
7. Andreasen JO (2011), Pulp and periodontal tissue repair - regeneration or tissue metaplasia after dental trauma. A review, Dental Traumatology.
8. Andriara De Rossi, Lea Assed Bezerra Silva, Patricia Gaton-Hernandez, Manoel Damiao Sousa-Neto, Paulo Nelson-Filho, Raquel Ased Bezerra Silva, Alexandra Mussolino de Queiroz (2014), Comparison of pupal responses to pulpotomy and pulp capping with Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate in dogs, Basic research biology, JOE.
9. Bartold PM, Shi S, Gronthos S (2006), Stem cells and periodontal regeneration, Periodontal, 40, pp.164-172.
10. Boyko G. A., Melcher A. H., Brunette D. M (1981), Formation of new periodontal ligament by periodontal ligament cells implanted in vivo after
culture in vitro. A preliminary study of transplanted roots in the dog, Journal of Periodontal Research, 16, pp.73-88.
11. Camila M. Corral Nunez, Helen J. Bosomworth, Claire Field, John M. Whitworth, Ruth A. Valentine (2014), Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate induce similar cellular responses in a fibroblast cell line, Basic research biology, JOE, 40(3).
12. Camilleri J, Piit Ford TR (2006), Mineral Trioxide Aggregate: a review of the constituents ang biological properties of th material, International Endodontic Journal, 39(10), pp.747-54.
13. Feng F, Akiyama K, Liu Y, Yamaza T, Wang TM, Chen JH, Wang BB, Huang GT, Wang S, Shi S (2010), Utility of PDL progenitors for in vivo tissue regeneration: a report of 3 cases, Oral Dis, 16, pp.8-20.
14. Gould T., Melcher A., and Brunette D. (1980), Migration and Division of Progenitor Cell Populations in Periodontal Ligament After Wounding, J Periodont Res, 15,pp.20-42.