1. hu tr nh sống củ nấm Cordycepsmilitaris
1.5.2. Tình hình sản xuất nấmC militari sở Việt Nam
Trong hai năm trở lại đây, thông tin về nấm ĐTHT xuất hiện khá nhiều trên các phương tiện thông tin đại chúng. Hầu hết các bài đều thông báo các đơn vị hoặc cá nhân có khả năng nuôi trồng thành công loại nấm này. Ở Việt Nam, cho tới nay, dựa vào thông tin công khai và có thể tìm thấy thì có khoảng gần 20 cơ sở, cá nhân có thể nuôi trồng thành công nấm C. militaris
cho ra chất trên nền thể quả, tạo ra sản phẩm. Một số ít trong đó có phép sản xuất dược phẩm chức năng để đưa ra thị trường.
Các đơn vị, cá nhân công khai nuôi trồng thành công nấm C. militaris
như: Viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ Sinh học, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, viện Bảo vệ Thực vật, công ty dược liệu quý, công ty dược phẩm Thiên Phúc, đại học Sư phạm Hà Nội, … và một số cá nhân như Kim Lai, Lê Thanh Tuyền…
Tuy có khá nhiều các cơ sở nuôi trồng nhưng năng suất, chất lượng được thông báo của các cơ sở không đồng đều. Tỉnh Vĩnh Phúc nhập 400 bình nuôi cấy của công ty Thiên Phúc và nuôi trong thời gian khoảng 2 tháng
19
thu đươc 2,8 kg nấm tươi. Như vậy, cứ 14 bình ta mới có 100 g nấm. Trong khi đó, Lê Ngọc Tuyền cho rằng nuôi cấy mật độ 12.000 lọ trên 100 m2
cho sản lượng cao nhất. Sau 2 tháng nuôi, mỗi lọ bên trong có 25-30 g nấm, trung bình 40 lọ được 1 kg nấm tươi, năng suất trung bình của quy trình này là tương đối cao.
Các loại hình sản phẩm về ĐTHT trong nước còn khá đơn giản, chủ yếu là bán thô. Tuy nhiên giá thành của chúng cũng không hề rẻ. Giá thông báo của một số cơ sở như là:
Lê Ngọc Tuyền: 150 triệu đồng/kg khô, 600.000 đồng/ lọ (25-30g tươi) Viện Bảo Vệ Thực Vật: 7 triệu đồng/kg tươi, 100-120 triệu đồng/nhộng. Thiên Phúc: 300.000-600.000 đồng/lọ.
Như vậy, có thể thấy, các sản phẩm về ĐTHT cần phải đa dạng hơn và phù hợp hơn với túi tiền của nhiều người Việt Nam.
20
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu được thực hiện từ tháng 8/2016 đến tháng 3/2017 tại Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
Chủng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris sp được sử dụng trong nghiên cứu do Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
.3.1. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng: Cân kĩ thuật (Sartorius, Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máyđo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi hấp khử trùng (HV - 110/HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan), Máy cất nước hai lần(Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV - 110/TELSTAR), Máy khuấy từ gia nhiệt (ARE/VELP, Italia), Cân phân tích (Sartorius, Đức).Máy phun sương…
2.3.2. Dụng cụ
Que cấy, khay cấy, túi nilon, bình tam giác, ống nghiệm, bình thủy tinh, đèn cồn, bình xịt cồn vỉ xốp nuôi cấy,…
2.4. Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy
- Môi trường được sử dụng trong nhân và giữ giống là môi trường PDA (Khoai tây: 200 g/L, glucose: 20 g/L, agar: 20 g/L,nước cất 1000 ml, pH=7)
- Môi trường chuẩn bị giống cấy là môi trường PDA lỏng(khoai tây: 200 g/L, glucose: 20 g/L, nước cất 1000 ml, pH=7), Bình nuôi cấy sau đó được chuyển sang máy lắc và lắc ở tốc độ 150 rpm trong điều kiện nhiệt độ 24 -25oC. Thời gian nuôi giống là 5 - 6 ngày.
21
- Môi trường nhân tạo nuôi trồng nấm là môi trường sử dụng các loại tinh bột(gạo lứt, gạo tẻ trắng , ý dĩ…) làm giá thể nuôi trồng chính và bổ sung nhộng tằm (nhộng tằm giai đoạn 5-7 ngày tuổi, đã được sử lý) ; đường sử dụng là đường glucose: 20 g/L môi trường. Sau đó môi trường được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
- Điều kiện nuôi cấy: pH của môi trường trồng nấm là 6.5-8. Môi trường sau khi được cấy giống sẽ để trong điều kiện tối từ 6-8 ngày cho hệ sợi nấm lan kín bề mặt. Sau đó, chuyển ra sáng với cường độ chiếu sáng là 1000- 1500 lux, thời gian chiếu sáng là 12 tiếng/ngày. Nhiệt độ 20-25oC, độ ẩm khoảng 80%.
2.5.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1.Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Sau 60-70 ngày nuôi cấy, đánh giá các chỉ tiêu: số lượng thể quả/bình, đặc điểm, kích thước thể quả, khối lượng tươi/ bình.
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nhộng tằm đến sự hình thành thể quả nấmC. militaris trên môi trường giá thể gạo tẻ
Bảng 2.1: Công thức ảnh hƣởng của nhộng tằm đến sự hình thành thể quả C.militaris trên môi trƣờng giá thể gạo tẻ
Công thức Môi trường
N1 100 g gạo tẻ/L + 20 g glucose/L + 0 g nhộng/L
N2 100 g gạo tẻ/L+ 20 g glucose/L+ 10 g nhộng/L
N3 100 g gạo tẻ/L+ 20 g glucose/L+ 30 g nhộng/L
22
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của gạo tẻ đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris
Bảng 2.2: Công thức ảnh hƣởng của gạo tẻ đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris
Công thức Môi trường
GT1 50 g gạo tẻ/L+ 20 g glucose/L+30 g nhộng/L
GT2 100 g gạo tẻ/L+ 20 g glucose/L+30 g nhộng/L
GT3 150 g gạo tẻ/L+ 20 g glucose/L+30 g nhộng/L
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của gạo lứt đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris
Bảng 2.3: Công thức ảnh hƣởng của gạo lứt đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris
Công thức Môi trường
GL1 100 g gạo lứt/L + 20 g glucose/L +30 g nhộng/L
GL2 150 g gạo lứt/L + 20 g glucose/L +30 g nhộng/L
23
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng củ ý dĩ đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris
Bảng 2.4: Công thức ảnh hƣởng của ý dĩ đến sự hình thành thể quả nấm
C. militaris
Công thức Môi trường
YD1 50 g ý dĩ/L + 20 g glucose/L +30 g nhộng/L
YD2 100 g ý dĩ/L+ 20 g glucose/L +30 g nhộng/L
YD3 150 g ý dĩ/L + 20 g glucose/L +30 g nhộng/L
Thí ngiệm 5: Ảnh hưởng của một số chất khoáng bổ sung đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris
Các chất khoáng vô cơ bổ sung theo nồng độ sau: MgSO4.7H2O: 0,5 g/L
KH2PO4: 0,5 g/L K2HPO4: 0,5 g/L NH4NO3: 1 g/L Vitamin B1: 3 mg/L
Theo đó, gồm 2 công thức sau:
CT1: 100 g gạo tẻ/L + 20 g glucose/L + 50 g nhộng/L
CT2: 100 g gạo tẻ/L + 20 g glucose/L + 50 g nhộng/L + các chất khoáng
2.5.2 Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm
Số liệu thực nghiệm được phân tích theo các tham số thống kê gồm trung bình mẫu, độ lệch chuẩn, phân tích thống kê số liệu ANOVA 1 yếu tố và kiểm tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phương pháp LSD của Fisher trên phần mềm Excel 2010 [4].
24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Giai đoạn hình thành thể quả là giai đoạn quan trọng nhất trong quá trình nuôi trồng nấm ĐTHT C. militaris, vì thể quả nấm là phần có giá trị dược liệu cao nhất. Môi trường khác nhau có vai trò quyết định đến năng suất của giai đoạn này. Các loại cơ chất ảnh hưởng đến sự hình thành thể quả và hình thái của chúng. Theo các nhà khoa học, môi trường sử dụng tinh bột và nhộng tằm là môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành thể quả. Ở đây chúng tôi sử dụng nguồn tinh bột là: gạo tẻ, gạo lứt, ý dĩ và nhộng tằm.
3.1. Ảnh hƣởng của nhộng tằm đến sự hình thành thể quả C. militaris trên môi trƣờng giá thể gạo tẻ môi trƣờng giá thể gạo tẻ
Nhộng là pha thứ ba của côn trùng biến thái hoàn toàn. Chúng chứa rất nhiều chất dinh dưỡng dự trữ từ pha sâu non [45]. Ngoài tự nhiên nó là vật chủ kí sinh cho nấm ĐTHT. Theo các nhà khoa học nhộng tằm là nguồn cung cấp nitơ chính, nên có vai trò quan trọng trong sự hình thành thể quả của nấm.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện tối ưu hàm lượng nhộng tằm bổ sung vào môi trường nuôi trồng nhân tạo. Sau 60 ngày nuôi trồng, kết quả thu được thể hiện dưới bảng 3.1 và hình 3.1. Theo đó, có thể nhận thấy ở công thức đối chứng N1 không bổ sung nhộng tằm thì không có sự hình thành thể quả; trong khi các công thức N2, N3, N4 có bổ sung nhộng tằm với các hàm lượng khác nhau thì đều có sự hình thành thể quả. Điều này chứng minh gạo trộn với nhộng tằm là cơ chất thích hợp hơn cho sự hình thành thể quả, phù hợp với kết quả nghiên cứu của Jin L.Y. al et (2009) [16].
25
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của nhộng tằmđến sự hình thành thể quả nấm
C. militaris trên môi trƣờng giá thể gạo tẻ
Công thức Số lượng/bình Chiều cao
(cm) Đặc điểm thể quả
N1 0,00 ± 0,00a 0,00 ± 0,00a Hệ sợi chuyển màu vàng và không hình thành thể quả.
N2 4,80 ± 1,30b 1,50 ± 0,38b
Số lượng thể quả ít, phân bố không đều, kích thước nhỏ, đầu tròn và có màu vàng cam nhạt.
N3 22,60 ± 3,36c 2,74 ± 0,36c
Số lượng thể quả trung bình, phân bố tương đối đều, kích thước trung bình và có màu vàng cam.
N4 28,60 ± 2,41d 3,48 ± 0,42d
Số lượng thể quả lớn, phân bố tương đối đều, kích thước lớn, dầu tròn và có màu vàng cam đậm.
Trong cùng một cột, các chữ theo s u há nh u , b, … thể hiện sự s i há ý nghĩ th ng kê với α=0,05.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy các công thức đều có sự sai khác về số lượng và chiều cao của thể quả. Công thức N4 với 50 g nhộng/L cho kết quả tốt nhất với 28,6 thể quả/bình và chiều cao trung bình thể quả đạt 3,48 cm. Trong khi đó, ở công thức đối chứng không cho thể quả và công thức N2 (10 g nhộng/bình) có sự hình thành thể quả rất kém với 4,8 thể quả/bình và chiều cao trung bình 1,5 cm (hình 3.1). Công thức N3 có số lượng thể quả trung bình lớn hơn công thức N1, N2 nhỏ hơn N4 với 22,6 thể quả/bình và chiều cao 2,74 cm. Như vậy công thức bổ sung 50 g nhộng/L cho hiệu suất tốt nhất.
26
Kết quả này tương tự với thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris của Phạm Thị Lan và cs (2016) [3].
Hình 3.1:Ảnh hưởng của nhộng tằm đến sự hình thành thể quả C.militaris trên môi trường giá thể gạo tẻ
a: môi trường không bổ sung nhộng tằm; b:môi trường bổ sung 10 g nhộng/L; c: môi trường bổ sung 50 g nhộng/L
3.2. Ảnh hƣởng của gạo tẻ đến sự hình thành thể quả nấm C.militaris
Trong nuôi trồng nấm trên môi trường nhân tạo, gạo là cơ chất được sử dụng nhiều nhất. Theo nghiên cứu của Wen và cs (2008) năng suất thể quả lớn nhất thu được khi sử dụng gạo [34].Trong đó, gạo tẻ vẫn là cơ chất phù hợp hơn cả về giá thành, năng suất và chất lượng sản phẩm. Do gạo cung cấp nguồn cacbon chính cho sự hình thành thể quả, vì vậy hàm lượng gạo sử dụng có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tạo thể quả. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các hàm lượng gạo tẻ khác nhau. Sau 60 ngày nuôi trồng, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.2.
27
Bảng 3.2:Ảnh hƣởng của gạo tẻ đến sự hình thành thể quả nấm
C. militaris
Công thức Số lượng/bình Chiều cao
(cm) Đặc điểm thể quả
GT1 6,20 ± 1,30a 3,12 ± 0,76
Số lượng thể quả ít, phân bố không đều, kích thước không đều, đầu thể quả tròn và có màu vàng cam đậm.
GT2 22,60 ± 3,36c 2,74 ± 0,36
Số lượng thể quảnhiều, phân bố tương đối đồng đều, kích thước ngắn, đầu tròn và có màu vàng cam.
GT3 17,40 ± 2,30b 3,34 ± 0,55
Số lượng thể quả trung bình, phân bố không đều, kích thước tương đối lớn nhưng không đều, đầu tròn và có màu vàng cam đậm
Trong cùng một cột, các chữ theo s u há nh u , b, … thể hiện sự s i há ý nghĩ th ng kê với α=0,05.
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy sự sai khác chiều cao thể quả của các công thức GT1, GT2, GT3 không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nghĩa là chiều cao của chúng tương đương nhau, trung bình khoảng 3 cm. Trong khi đó, sự khác biệt về số lượng thể quả/bình rất rõ rệt (hình 3.2). Công thức GT2 cho kết quả tốt nhất với 22,6 thể quả/bình gấp 3,6 lần công thức GT1 (6,2 thể quả/bình) và gấp 1,3 lần công thức GT3 (17,4 thể quả/bình). Như vậy, môi trường sử dụng gạo tẻ với hàm lượng 100 g/L là môi trường thích hợp cho sự hình thành thể quả.
28
Hình 3.2: Thể quả sau 60 ngày nuôi trồng trên các loại cơ chất gạo
a: Môi trường GT1; b: Môi trường GT2; c: Môi trường GT3 d: Môi trường GL1; e: Môi trường GL2; f: Môi trường GL3
3.3. Ảnh hƣởng của gạo lứt đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris
Gạo lứt là loại gạo rất giàu dinh dưỡng đặc biệt là các sinh tố và nguyên tố vi lượng [15] Jae và cs (2006) đã xác định cơ chất thích hợp nhất cho nuôi trồng ĐTHT trên giá thể nhân tạo là gạo lứt. Trong nhiều các thí nghiệm khác các nhà khoa học cũng chọn gạo lứt làm giá thể nuôi trồng ĐTHT như trong nghiên cứu của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của
nấm Cordyceps militaris của Đặng Xuân Hoàng và cs (2016). Tuy nhiên gạo
lứt được sử dụng như thế nào với hàm lượng bao nhiêu thì ít được công bố. Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện đánh giá ảnh hưởng của các hàm
29
lượng gạo lứt khác nhau đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris. Sau 60 ngày nuôi trồng, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3:Ảnh hƣởng của gạo lứt đến sự hình thành thể quả nấm
C. militaris
Công thức Số lượng/bình Chiều cao
(cm) Đặc điểm thể quả
GL1 12,40 ± 1,82a 2,08 ± 0,37a
Số lượng thể quả ít, phân bố không đều, kích thước nhỏ, đầu thể quả nhọn, xẻ thùy và có màu cam đậm.
GL2 20,20 ± 1,92b 4,36 ± 0,70b
Số lượng thể quả tương đối nhiều, phân bố tương đối đồng đều, kích thước lớn, đa số bị xẻ thùy và có màu cam.
GL3 10,08 ± 1,92a 4,04 ± 0,63b
Số lượng thể quả ít, phân bố không đều, kích thước tương đối lớn nhưng không đều, bị xẻ thùy và có màu cam.
Trong cùng một cột, các chữ theo s u há nh u , b, … thể hiện sự sai khác có ý nghĩ th ng kê với α=0,05.
Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy hai công thức GL1 và GL3 có số thể quả/bình tương đương nhau và rất ít (khoảng 10 thể quả/bình), phân bố không đều. Trong đó, công thức GL2 có số lượng thể quả/bình gấp ≈ 2 lần công thức GL1, GL3 với 20,2 thể quả/bình và thể quả phân bố tương đối đều. Trong nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước tới sinh trưởng và phát triển của nấm C. militaris, Lương Thị Hương Lan và cs cho rằng môi trường có tỉ lệ w/v của gạo lứt và nước càng cao thì số lượng thể quả thu
30
được càng thấp [2]. Tuy nhiên, trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi, điều này chỉ đúng với công thức GL2 so GL3. Khi so sánh GL1 với GL2 lại thu được kết quả ngược lại. Điều này hoàn toàn hợp lý, vì khi tỉ lệ w/v quá thấp nghĩa là hàm lượng nước quá cao dẫn đến môi trường lỏng, gây khó khăn cho việc hình thành thể quả.
Hình 3.3: Thể quả bị dị dạng
a: Thể quả bị xẻ thùy đầu tròn ; b: Thể quả mọc cụm và bị phân nhánh ; c: thể quả bị xẻ thùy và kích thước dị dạng
Chiều cao của các công thức cũng có sự khác biệt rõ ràng. Mặc dù số lượng thể quả/bình của GL3 và GL1 tương đương nhau, nhưng chiều cao thể quả của công thức GL3 (4,04 cm) gấp gần 2 lần so với công thức GL1 (2,08 cm) và tương đương với chiều cao thể quả công thức GL2 (4,36 cm) (bảng 3.3). Một số các thể quả có hiện tượng xẻ thùy, phân nhánh như trong hình 3.3. Như vậy, trong ba công thức thí nghiệm, công thức GL2 (150 g gạo/L) thích hợp nhất cho sự hình thành thể quả.
3.4.Ảnh hƣởng của ý dĩ đến sự hình thành thể quả nấm C. militaris