4. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi
BAP là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến trong nhân nhanh chồi. Việc bổ sung BAP vào môi trường nuôi cấy không những làm
tăng kích thước của tế bào mà nó còn kích thích quá trình trao đổi chất [8].
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP (0,1-1,5 mg/l) lên khả năng nhân chồi của Củ mài được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng3.2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6 tuần nuôi cấy
CT Số
chồi/mẫu Số lá/ chồi
Chiều cao chồi(cm)
Đặc điểm chồi tái sinh
ĐC 1,50± 0,55a 6,50 ± 1,05b 5,65 ± 0,50c
Thân màu tía, cao, lá to, màu xanh
đậm
B0,1 3,83± 0,75c 2,17 ± 0,75a 2.10 ± 0,26a
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
B0,3 5,00± 0,89d 2,50 ± 0,55a 3.22 ± 0,21b
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
B0,5 2,50 ± 0,55b 2,17 ± 0,41a 2,23 ± 0,56a
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
B1,0 2,67± 0,82b 2,83 ± 0,75a 2.93 ± 0,22b
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
B1,5 3,00± 0,63bc 2,33 ± 0,82a 2.35 ± 0,19a
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05.
Ảnh hưởng của BAP đến số chồi trên mẫu: Kết quả cho thấy BAP đã kích thích sự hình thành chồi. Số lượng chồi đạt tỉ lệ cao nhất 5,00 chồi trên mẫu ở CT B0,3 mg/l, chồi thu được là chồi có thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu xanh nhạt( Hình 3.2b). Tiếp đến CT B0,1 cho số lượng chồi là 3,83 (Hình 3.2a). Ở CT B0.5, B1, B1.5 có số chồi trên mẫu gần như nhau( 2,5, 2,67, 3)
(Hình 3.2c). Tại các công thức bổ sung BAP chồi thu được đều là chồi thân màu tía thấp lá màu xanh nhạt. Tuy nhiên ở công thức đối chứng đặc điểm của chồi tốt hơn, chồi cao, lá màu xanh đậm.
Ảnh hưởng của BAP đến số lá trên chồi và chiều cao chồi: Kết quả thu được cho thấy BAP không ảnh hưởng nhiều tới số lá trên chồi, chiều cao chồi. Giữa các công thức số lá gần như tương đương nhau (2.17, 2.5, 2.17, 2.83, 2.33), chiều cao chồi cũng không có sự sai khác.
Như vậy, khi nghiên cứu ảnh hưởng của BAP (0,1-1,5 mg/l) đến khả
năng nhân chồi in vitro của củ mài chúng tôi đi đến kết luận 0,3 mg/l BAP là
môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất với 5,00 chồi/mẫu. Còn khi không bổ sung BAP(công thức đối chứng) thì chồi đạt được chiều cao tốt nhất 5,65 cm và cho số lá trên chồi, hình thái chồi tốt nhất.
Thankappan (2012) khi nghiên cứu về Dioscorea wallichii cho rằng
môi trường BAP 2 mg/l là thích hợp nhất để tạo chồi với số chồi đạt 2,6 chồi [33].Sở dĩ có sự khác nhau đó có lẽ là do đối tượng nghiên cứu khác nhau.
3.2.2. Ảnh hƣởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi
Các chồi của củ mài được cấy lên môi trường cơ bản MS bổ sung tổ hợp BAP (0,5-2,0 mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA để thăm dò khả năng nhân
nhanh chồi in vitro. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6 tuần nuôi cấy
BAP NAA Số chồi/mẫu Số lá/chồi Chiều cao
chồi(cm)
Đặc điểm chồi tái sinh
0,00 0,00 1,50 ± 0,55a 6,50 ± 1,05c 5,48 ± 0,34d +++ 0,50 0,50 4,50 ± 1,05b 1,67 ±0,82a 1,85 ± 0,39a ++ 1,00 0,05 3,67 ± 0,82b 1,83 ± 0,75a 2,62 ± 0,39a ++ 1,50 0,50 6,83 ± 1,47c 1,50 ± 0,54a 3,83 ± 1,38b ++ 2,00 0,50 1,83 ± 0,75a 3,17 ± 0,75b 4,97 ± 0,72c +
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
+++: Thân màu tía, cao, lá to, màu xanh đậm ++: Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu xanh nhạt + : Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu tía
Kết quả thu được cho thấy, môi trường kết hợp 1,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA là môi trường thích hợp cho sự hình thành và sinh trưởng của chồi (đạt 6,83 chồi)(Hình 3.2e). Trong khi đó, môi trường MS và môi trường kết hợp 2 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA thì số lượng hình thành chồi thấp (đạt 1,83 chồi) (hình 3.2f)
Theo Behera và cs (2008) sử dụng môi trường MS bổ sung BAP 2,0
mg/l +NAA 0,5 mg/l + acid ascorbic 100 mg/l trên loài Dioscorea hispida với
hệ số nhân nhanh 6 lần [24]. Các kết quả trên cho thấy có sự sai khác với kết quả của tôi đưa ra, nguyên nhân có thể là do vật liệu nuôi cấy là các loài khác nhau.
3.3. Ảnh hƣởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Củ mài in vitro
Tạo rễ là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân nhanh in vitro. Với mục
đích tạo cây con có sức sống cao, đạt tiêu chuẩn ra cây. Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hoá rễ. Những auxin được dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là NAA. Để tăng khả năng ra rễ cho chồi củ mài nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành lấychồi của củ mài thu được từ các thí nghiệm trên tách riêng lẻ và cấy lên môi trường cơ bản MS bổ sung NAA(0,1;0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/l )để
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA lên khả năng nhân chồi của củ mài sau 6 tuần nuôi cấy
Công thức Số rễ/ chồi Chiều dài
rễ(cm) N0,1 5,80 ± 0,84a 8,84 ± 0,27a N0,2 8,00 ± 1,58c 15,14 ± 0,29c N0,3 7,40 ± 1,52bc 14,74 ± 0,46c N0,4 6,00 ± 0,70ab 9,54 ± 0,36b N0,5 5,20 ± 0,84a 9,08 ± 0,19a
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
Hình 3.3: Rễ cây Củ mài in vitro
A: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,1l; B: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,2; C: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,3; D: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,4; E: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,5.
Kết quả ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của củ mài được trình bày tại bảng 3.4 cho thấy, môi trường bổ sung 0,2 mg/l NAA là môi trường thích hợp nhất cho quá trình hình thành rễ của củ mài với trung bình là 8,00
rễ/chồi (Hình3.3b); chiều dài rễ đạt giá trị lớn nhất 15,14 cm ở nồng độ 0,2 mg/l. Ở các chồi này rễ phát triển gần như hoàn chỉnh giống với rễ củ mài ngoài tự nhiên, rễ có kích thước lớn, màu trắng. Khi tăng nồng độ lên 0,5 mg/l NAA chúng tôi nhận thấy quá trình phát triển của rễ bị ức chế dẫn đến sự hình thành rễ ít hơn, rễ có kích thước ngắn hơn.
3.4. Huấn luyện cây Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự
nhiên.
Việc thuần hoá cây ngoài vườn ươm là một khâu quan trọng, đảm bảo cây có tỉ lệ sống cao, sinh trưởng tốt khi đưa cây vào điều kiện sản xuất. Kết
quả rèn luyện cây Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên được thể
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần hoá cây Củ mài in vitro
Giá thể Tỷ lệ sống(%) Hình thái cây
Đất thịt nhẹ
100 Cây cứng, khỏe, tạo
rễ mới Đất cát
pha
95 Cây mảnh, tạo rễ mới
Đất: cát(1:1)
98 Cây cứng, khỏe, tạo
rễ mới
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
Hình 3.4: Rèn luyện cây con ngoài tự nhiên
A: Cây Củ mài in vitro được trồng trên già thể đất: cát (1:1) sau 3 tuần huấn luyện
B: Cây Củ mài in vitro được trồng trên già thể đất thịt nhẹ sau 3 tuần huấn luyện
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa về ảnh hưởng của loại giá thể lên tỷ lệ sống của cây Củ mài ngoài vườn ươm. Tất cả đều cho tỷ lệ sống cao. Tuy nhiên giá thể đạt tỷ lệ cây sống 100% là đất thịt nhẹ. Trong đó, giá thể đất thịt nhẹ cho cây cứng, khỏe, tạo rễ mới được đánh giá là giá thể thích hợp để chuyển cây Củ mài ra vườn ươm.
Quy trình nhân giống in vitrocây Củ mài
Ethanol 70%+ Javel 7% 10 phút
MS+BAP 1,5+ NAA 0,5 Thân non cây Củ
mài NAA 0,2 Đất thịt nhẹ Mẫu vô trùng 6 tuần 6 tuần
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận.
Dựa vào những kết quả thu được từ những thí nghiệm trên, tôi rút ra một số kết luận sau:
1.1. Sử dụng javen 7% trong 10 phút để khử trùng quả lan tạo vật liệu in
vitro cho quá trình nhân giống cây Củ mài. Phương pháp này đạt hiệu quả khử trùng cao với tỷ lệ mẫu sống vô trùng là 83,33%.
1.2. Môi trường cơ bản MS có 30g/l saccarose, 7g agar/l bổ sung BAP
(1,5 mg/l) và 0,5mg/l NAA thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi in vitro.
Số chồi hình thành đạt 6,83 chồi mới sau 6 tuần nuôi cấy.
1.3. Môi trường cơ bản MS có 30g/l saccarose, 7g agar/l bổ sung NAA
(0,2 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, đạt 8,00 rễ/chồi sau 6 tuần nuôi cấy.
1.4. Cây con được trồng trên giá thể đất thịt nhẹ cho tỷ lệ sống đạt 100%.
2. Kiến nghị.
2.1. Tiếp tục nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu với các hóa chất khác và trên nhiều bộ phận khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, (2004). Cây thuốc và động vật làm
thuốc ở Việt Nam.NXB Khoa hoc kỹ thuật Hà Nội.
2. Đỗ Năng Vịnh (2002).Công nghệ sinh học cây trồng, Nhà xuất bản
Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Đỗ Năng Vịnh (2007), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nhà xuất
bản Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Đỗ Tất Lợi, (2004), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học Hà
Nội.
5. Đỗ Thị Lan Hương, Trần Văn Ba, (2008). “Nghiên cứu đặc điểm hình
thái và cấu tao giải phẫu thích nghi với chức năng của một số cây trong học
củ nâu (Dioscoreacea)”.Tạp chí khoa học ĐH Sư phạm Hà Nội 2,2008, số 5.
6. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học
thực vậttrong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
7. Ngô Xuân Bình, Bùi bảo Hoàn, Nguyễn Thúy Hà (2003), Giáo trình
công nghệsinh học, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
8. Nguyễn Bảo Toàn, 2004, Nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Nhà xuất
bản Đại học Cần Thơ. Trang 28-32.
9. Nguyễn Hồng Quân, (2006). “Cẩm nang ngành lâm nghiệp-chương
Lâm sản ngoài gỗ”: Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn-chương trình hỗ
trợ ngành lâm nghiệp và đối tác, trang 130.
10.Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng, (2012). Sinh lý học thực vật”.
NXB Giáo dục.
11.Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương
Thảo (2005),Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp,Nxb Nông nghiệp,
Hà Nội.
12.Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Trường Sơn, Đỗ
phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp)”, Báo cáo khoa học, hội nghị CNSH toàn quốc 2003, trang 850-855.
13.Nguyễn Thị Hiền, (2014). “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và
hóa học của một số loài thuộc chi Củ mài (Dioscorea L.) tại Vĩnh Phúc”: Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện hàn lâm khoa học Việt Nam.
14.Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Lan, Nguyễn Thành Luân (2007), “Ảnh
hưởng của một số yếu tố môi trường và giá thể đến sinh trưởng của cây lan
Dendrrobium hybrid invitro", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Trường đại học Thái Nguyên(3), trang 105-108.
15.Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong, (2013). Phương
pháp nghiên cứu Sinh lý học thực vật.NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
16. Nguyễn Xuân Linh (2002),Giáo trình kĩ thuật trồng hoa cây
cảnh,Nxb Nôngnghiệp, Hà Nội.
17.Phạm Quang Trung, “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái của cây
củ mài và khả năng hôm giống bằng hom củ trong giai đoạn vườn ươm tại
rừng đạc dụng Copia huyện Thuận Châu tỉnh Sơn La”: Trường Đại học Tây
Bắc, Luận văn thạc sỹ.
18.Võ Văn Chi, 1997. Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, trang
328-332.
19.Võ Văn Chi, 2007, Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam.Nxb Giáo dục.
20.Vũ Thanh Sắc, Vũ Văn Vụ, Trần Thị Liên, Tạ Như Thụ Anh, Nguyễn
Văn Thuận (2009), “Nghiên cứu nhân giống invitro cây Ban Âu Hypericum
perforatum 1.”, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2009, Trang 237-239.
21.Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2008), Công nghệ
* Tài liệu tiếng Anh
22.Alizadeh S., Mantell SH, Viana AM. (1998), “In vitro culture and
microtuber induction in the steroidal yamDioscorea composite Hemsl”, Plant
Cell Tissue Organ Cult , 5(3), pp.107-112.
23.Ayensu ES. (1972), “Anatomy of the monocotyledons VI
Dioscoreales”.Oxford Press, Oxford,p.182.
24.Behera K.K., Sahoo S, Prusti A. (2008), “Efficient in vitro
micropropagation of greater yam (Dioscorea alata L.cv. Hinjilicatu) through
nodal vine explants”, Indian Journal of Plant Physiol, (14), pp.250-256.
25.Borges M., Ceiro W., Meneses S., Aguilera N., Vazquez J., Infante Z.
and Fonseca M. (2004), “Regeneration and multiplication of Dioscorea alata
germplasm maintained in vitro”. Plant Cell Tiss.Org.Cult, 7(6), pp.87-90.
26.Fotso, Ngo Ngwe Marie Florence Sandrine1, DjocgouePierre François
and Omokolo Ndoumou Denis (2013), “Micropropagation of Dioscorea alata
L. from microtubers induced in vitro”, African Journal of
Biotechnology,12(10), pp.1057-1067
27.Jasik J, Mantell SH. (2000), “Effects of jasmonic acid and its methyl
esteron in vitro microtuberization of three food yam (Dioscorea) species”,
Plant Cell Rep, 19, pp.863-867.
28.Jean M. and Cappadocia M. (1992), “Effects of growth regulators on
in vitro tuberization in Dioscorea alata L „Brazo fuerte‟ and D.abyssinica
Hoch”. Plant cell Rep, (11), pp.34-38.
29.Kohmura H., Araki H. and Imoto M. (1995), “Micropropagation of
„yam atoimo‟ Chineseyam (Dioscorea opposita Thunb.) from immature
leaves”, Plant Cell Tiss.Org.Cult , (40), pp.271-276.
30.Mantell SH, Hugo SA. (1989), “Effects of photoperiod, mineral
medium strength, inorganic ammonium, sucrose and cytokinin on root, shoot
and microtuber development in shoot cultures of Dioscorea alata L. and
31.Murashige T. and Skoog F. (1962), “A revised medium for rupid
growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol. Plant 15: 473 -
479.
32.Supriya Das, Manabendra Dutta Choudhury and Pranab Behari
Mazumdar, (2013), “Micropropagation of Dioscorea alata L. through nodal
segments”, African Journal of Biotechnology, Vol. 12(47), pp. 6611-6617.
33.Thankappan and K. Abraham, (2012). “Micropropagation and
Microtuber Induction in Dioscorea wallichii Hook.f.”, Journal of Root Crops,
2012, Vol. 38 No. 2, pp. 109-115
34.Tor M., Twyford CT., Funes I., Boccon-Gibod J., Ainsworth CC. and
Mantell SH. (1998), “Isolation and culture of protoplasts from immature
leaves and cell suspension of Dioscorea yams: Tools for transient gene
expression studies”, Plant Cell Tiss.Org.Cult, 53, pp.113-125.
35.Twyford CT., Mantell SH. (1996), “Production of somatic embryos
and plantlets from root cells of Greater Yam”, Plant Cell Tiss.Org.Cult , 46,
pp.17-26.
36.Ukaegbu M., Okpuzor J. (2010), “A Study Of Changes In Some
Biochemical Parameters During Bacterial Fermantation Of Dioscorea
EsculentaTubers”, Report and Opinion, 2(6), pp.88-93.
* Tài liệu internet
37.Đại học Tây Bắc, 2012. Nhân giống bằng hạt, thuận lợi và khó
khăn.<http://app.utb.edu.vn>
38.Hải Lan, 2011, Củ mài hỗ trợ điều trị bệnh nhân đái tháo đường typ
2.<http://cadn.com.vn>
39.Traphaco, 2011. Ngân hàng Thế giới tài trợ cho “Đề án thuộc Dự án
GreenPlan” của Traphaco thông qua Chương trình Ngày sáng tạo Việt Năm 2011.<http://www.traphaco.com.vn>
PHỤ LỤC
Nhân nhanh chồi Củ mài in vitro
