Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mái ở Việt- 123docz.net

4. Nội dung nghiên cứu

1.3.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mái ở Việt Nam

Năm 2011 sau cuộc thi Chương trình sáng tạo Việt Nam[39] công ty cổ phần Traphaco được nhận tài trợ của ngân hàng thế giới với đề án : Xây dựng

bộ nhận diện Củ mài (Dioscoreae persimilis) và vị thuốc hoài sơn. Hiện nay,

công ty vẫn đang tiến hành nghiên cứu về giống cây Củ mài: phương pháp trồng, thu hoạch và chủ yếu là phương pháp nghiên cứu chế biến Củ mài thành những vị thuốc. Trong dự án hợp tác kỹ thuật- Dự án nâng cao năng lực nghiên cứu tại trường Đại học Tây Bắc hợp tác với tổ chức JICA Nhật Bản có một hợp phần nghiên cứu về - Giải pháp kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế cây Củ mài tại khu vực đèo Pha Đin tỉnh Sơn La đang tiến hành nghiên cứu về đặc điểm hình thái nhận dạng cây Củ màicũng như nghiên cứu về biện pháo gây trồng loài cây này trên thực địa [37].

Ngoài các nghiên cứu của các tác giả trên còn có nghiên cứu khác về

hình thái, giải phẫu thực vật như: Đỗ Thị Lan Hương (2004) [5] đã tiến hành

nghiên cứu đạc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu thích nghi của một số cây trong ba họ bầu bí, củ nâu, khoai lang. Trong nghiên cứu này đã đề cập đến hình thái giải phẫu của thân, lá, rễ và củ cây Hoài sơn và một số loại cây thuộc họ Củ nâu (củ từ năm lá, củ từ lông).

Nghiên cứu ứng dụng Củ mài trong y học: các công trình nghiên cứu cơ bản về loài cây Củ màicòn rất ít chủ yếu là những nghiên cứu về công dụng làm thuốc của cây Củ mài. Từ rất lâu đời cây Củ màiđã được các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực y học viết nên những cuốn cẩm nang về vai trò của Củ mài trong việc chữa bệnh cho con người.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng Củ mài trên thế giới.

Cây Củ mài rất phổ biến ở Trung Quốc nhất là những vùng đồi núi hoặc ven chân núi. Theo kinh nghiệm dân gian người dân thường đi đào Củ màivề để chế bến thành các món ăn (trộn cơm, nấu canh, ...). Ngoài ra Củ mài sau khi sấy khô còn được sử dụng làm thuốc bắc

Nhật Bản: Một số trường đại học đã nhiên cứu và phân loại các cây trong họ Củ Nâu. Các sản phẩm đó cũng đã được đưa vào sử dụng trong cuộc sống. Nghiên cứu về thời gian ngủ nghỉ và tác động của hóa chất sinh trưởng. Ảnh hưởng của điều kiện sinh dưỡng tới sự sinh trưởng và phát triển của cây Củ mài.

Người dân Nhật Bản sử dụng Củ mài để làm thực phẩm như lấy chất nhầy, trộn thêm các thức ăn khác: tương, trứng sống, cơm... Ngoài ra,Củ mài còn được chế biến làm sạch đóng gói và bảo quản lạnh thành các sản phẩm để bán trong siêu thị nhà hàng.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu

Sử dụng nguồn vật liệu là thân và củ của cây củ màiđược thu tại thôn Xóm Mới – xã Mường Khương – huyện Mường Khương – tỉnh Lào Cai.

2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 10/2016 đến tháng 02/2017 tại Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.

2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 2.3.1. Thiết bị 2.3.1. Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật : Cân kĩ thuật (Sartorius, Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi hấp khử trùng (HV - 110/HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan), Máy cất nước hai lần (Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV - 110/TELSTAR), Máy khuấy từ gia nhiệt (ARE/VELP, Italia), Cân phân tích (Sartorius, Đức)…

2.3.2. Dụng cụ

Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn vỉ xốp nuôi cấy,…

2.4. Môi trƣờng nuôi cấy

pH môi trường: 5,8.

Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 117 o

C trong 15 phút.

- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng

cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [31] bổ sung 30g/l saccharose, 7g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng : Kinetin (KI), 6 - Benzylamino purine (BAP) và α - Napththalenacetic acid (α-NAA).

2.5. Điều kiện nuôi cấy

Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.

Quang kì: 16 giờ/ngày.

Nhiệt độ phòng: 25 o

C - 27 oC. Độ ẩm trung bình: 70% - 74%.

2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.6.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo các bước của sơ đồ nghiên cứu (hình 2.1) như sau:

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

2.6.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.6.2.1. Tạo vật liệu khởi đầu

Xử lí sơ bộ thân cây Củ mài bằng cách: rửa xà phòng dưới vòi nước chảy, rửa lại bằng nước cất khử trùng trong buồng cấy vô trùng, lắc mẫu trong etanol 70% (v/v)/ 5 phút + nước cất khử trùng 2-3 lần, tiếp đến khử trùng bằng dung dịch Javen 3-9% trong 5-10 phút theo bảng 2.1

Cuối cùng, thân được rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng trước khi cấy lên môi trường cơ bản MS có 30g/l saccharose, 7g/l agar.

Đánh giá thí nghiệm sau 2 tuần theo dõi dựa trên tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sạch sống, tỉ lệ mẫu sạch chết ở từng công thức.

Cây củ mài ngoài tự nhiên Tạo vật liệu khởi đầu - khử

trùng thân non

Nhân nhanh chồi in vitro

Tạo rễ - hình thành cây

in vitro hoàn chỉnh

Rèn luyện cây in vitro ngoài

Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Củ mài

Công thức Chất xử lý/ thời gian

ĐC Xử lý sơ bộ CT1 Xử lý sơ bộ + javen 3%(v/v)/10 phút CT2 Xử lý sơ bộ + javen 7%(v/v)/5phút CT3 Xử lý sơ bộ + javen 7%(v/v)/10 phút CT4 Xử lý sơ bộ + javen 9%(v/v)/10 phút

Đánh giá thí nghiệm sau 15 ngày theo dõi dựa trên các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu nhiểm, tỷ lệ mẫu sạch sống, tỷ lệ mẫu sạch chết.

2.6.2.2. Tái sinh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh của chồi cây Củ mài.

Môi trường nuôi cấy: sử dụng môi trường cơ bản là MS( Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 3% saccharose, chất điều tiết sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau tùy thuộc vào từng thí nghiệm, pH môi trường là 5,8.

Nhiệt độ phòng nuôi cấy được duy trì ở 24- 26°C, cường độ chiếu sáng là 1.800- 2000 lux.

Bố trí thí nghiệm:

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức thí nghiệm tiến hành 3 lần nhắc lại, bố trí 3 bình mẫu. Số liệu được xử lý thống kê.

a, Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi của cây Củ mài.

Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của BAP đến nhân nhanh chồi Củ mài in vitro

Công thức Chất ĐC MScơ bản CT1 BAP 0,1(mg/l) CT2 BAP 0,3(mg/l) CT3 BAP 0,5(mg/l) CT4 BAP 1,0(mg/l) CT5 BAP 1,5(mg/l)

Đánh giá thí nghiệm sau 6 tuần nuôi cấy dựa trên các chỉ tiêu: số chồi, chiều cao chồi, số lá trên chồi và đặc điểm chồi tái sinh.

b, Ảnh hƣởng của BAP kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi của cây Củ mài

Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng của BAP kết hượp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Củ mài

Công thức Chất ĐC MS cơ bản CT1 BAP 0,5(mg/l)+NAA 0,5(mg/l) CT2 BAP 1,0(mg/l)+NAA 0,5(mg/l) CT3 BAP 1,5(mg/l)+NAA 0,5(mg/l) CT4 BAP 2,0(mg/l)+NAA 0,5(mg/l)

Đánh giá thí nghiệm sau 6 tuần nuôi cấy dựa trên các chỉ tiêu: số chồi, chiều cao chồi, số lá trên chồi và đặc điểm chồi tái sinh.

2.6.2.3. Ra rễ tạo cây Củ mài in vitro hoàn chỉnh.

- Các chồi thu được từ thí nghiệm trên được cấy sang môi trường tạo rễ là môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau.

Bảng 2.4: Công thức ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ Củ mài in vitro Công thức Chất CT1 NAA 0,1(mg/l) CT2 NAA 0,2(mg/l) CT3 NAA 0,3(mg/l) CT4 NAA 0,4(mg/l) CT5 NAA 0,5(mg/l)

Theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường thí nghiệm với các chỉ tiêu theo dõi: số rễ, chiều dài rễ.

2.6.2.4. Huấn luyện cây Củ màiin vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên nhiên

- Những cây sinh trưởng tốt và có bộ rễ sinh trưởng đồng đều thu được

từ nuôi cấy invitro được chuyển ra ngoài vườn ươm và trồng các loại giá thể

- Bố trí thí nghiệm:

Bảng 2.5: Công thức ảnh hưởng của giá thể tới sự thích nghi của cây Củ mài in vitro ngoài tự nhiên

Công thức Giá thể ĐC 100% đất CT1 Đất thịt nhẹ CT2 Đất cát pha CT3 Đất: cát(1:1) 2.7. Phƣơng pháp thống kê.

Số liệu thực nghiệm được phân tích theo các tham số thống kê gồm trung bình mẫu, độ lệch chuẩn, phân tích thống kê số liệuANOVA 1 yếu tố và kiểm tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phương pháp LSD của Fisher trên phần mềm Excel 2010[15].

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu

Đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy ngoài tự nhiên vào điều kiện

nuôi cấy in vitro. Đối với mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải xác định

phương thức khử trùng khác nhau cho thích hợp. Thành công của giai đoạn này không chỉ phụ thuộc vào đối tượng cụ thể, cách lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu mà còn phụ thuộc vào chất khử trùng và thời gian khử trùng. Giai đoạn này cần đạt các tiêu chuẩn: tỷ lệ nhiễm khuẩn, nấm thấp và tỷ lệ sống cao, mô tồn tại phân hóa và sinh trưởng tốt. Do đó, việc xác định phương thức khử trùng có ý nghĩa quyết định đối với sự thành công ban đầu và quá trình nhân giống tiếp theo.

Đề tài đã sử dụng thân non cây Củ mài để tạo vật liệu vô trùng. Thân được khử trùng trong javen 3%, 7%, 9% trong thời gian 5, 10 phút sau đó cấy vào môi trường.

Tỷ lệ mẫu sạch khuẩn, nấm trong ống nghiệm là chỉ tiêu đánh giá kết quả khử trùng mẫu. Sau 15 ngày theo dõi kết quả được trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu đốt thân cây củ mài

C ông thức Chất xử lý/thời gian Tỷ lệ(%) Mẫu nhiễm Mẫu sống Mẫu chết 1 Xử lí sơ bộ 100 0,00 0,00 2 Xử lí sơ bộ +javen 3%(v/v)/10 phút 77,78 22,22 0,00 3 Xử lí sơ bộ+ javen 7%(v/v)/5 phút 55,56 44,44 0,00 4 Xử lí sơ bộ+ javen 7%(v/v)/10 phút 16,67 83,33 0,00 5 Xử lí sơ bộ+ javen 9%(v/v)/10 phút 38,89 38,89 22,22

Theo bảng 3.1 cho thấy mẫu khử trùng ở CT1 đối chứng (xử lý sơ bộ)

không cho hiệu quả khử trùng mẫu in vitro, các mẫu bị nhiễm sau 3-5 ngày

khử trùng với mẫu in vitro. Tuy nhiên có sự khác nhau về hiệu quả, CT4 (xử lí sơ bộ+javen 7%(v/v)/10 phút) cho hiệu quả khử trùng tốt nhất đạt 83,33%.

Supriya Das và cs (2013) khi nghiên cứu trên đối tượng Dioscorea

alata L. đã sử dụng HgCl2 0,1% (w/v) trong thời gian 5 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất [32].

Hình 3.1: Tạo vật liệu khởi đầu A: Thân non cây Củ mài A: Thân non cây Củ mài B:Mẫu Củ mài sạch bệnh.

3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây củ mài.

Sự hình thành và nhân nhanh chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc

tạo ra lượng lớn cây con in vitro, quyết định hiệu quả của quy trình nhân

giống. Quá trình tái sinh và nhân nhanh thường phụ thuộc vào các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là các chất thuộc nhóm cytokinin và trong một số trường hợp là các chất thuộc nhóm auxin và gibberellin ở nồng độ thấp hoặc sự kết hợp giữa chất thuộc nhóm cytokinin với chất thuộc nhóm auxin. Các cytokinin được sử dụng phổ biến là BAP. Các auxin được sử dụng phổ biến là NAA.

Hình 3.2: Tái sinh và nhân nhanh chồi Củ mài in vitro

A: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường B0,1; B: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường B0,3; C: Mẫu nuôi cấy trong môi trường B0,5; D: Mẫu nuôi cấy trong môi trường B0,5+N0.5; E: Mẫu nuôi cấy trong môi trường B1,5+ N0,5; F: Mẫu nuôi cấy trong môi trường B2,0+ N0,5.

3.2.1. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi

BAP là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến trong nhân nhanh chồi. Việc bổ sung BAP vào môi trường nuôi cấy không những làm

tăng kích thước của tế bào mà nó còn kích thích quá trình trao đổi chất [8].

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP (0,1-1,5 mg/l) lên khả năng nhân chồi của Củ mài được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng3.2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6 tuần nuôi cấy

CT Số

chồi/mẫu Số lá/ chồi

Chiều cao chồi(cm)

Đặc điểm chồi tái sinh

ĐC 1,50± 0,55a 6,50 ± 1,05b 5,65 ± 0,50c

Thân màu tía, cao, lá to, màu xanh

đậm

B0,1 3,83± 0,75c 2,17 ± 0,75a 2.10 ± 0,26a