4. Nội dung nghiên cứu
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.3.1. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật : Cân kĩ thuật (Sartorius, Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi hấp khử trùng (HV - 110/HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan), Máy cất nước hai lần (Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV - 110/TELSTAR), Máy khuấy từ gia nhiệt (ARE/VELP, Italia), Cân phân tích (Sartorius, Đức)…
2.3.2. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn vỉ xốp nuôi cấy,…
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy
pH môi trường: 5,8.
Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 117 o
C trong 15 phút.
- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng
cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [31] bổ sung 30g/l saccharose, 7g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng : Kinetin (KI), 6 - Benzylamino purine (BAP) và α - Napththalenacetic acid (α-NAA).
2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.
Quang kì: 16 giờ/ngày.
Nhiệt độ phòng: 25 o
C - 27 oC. Độ ẩm trung bình: 70% - 74%.
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.6.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo các bước của sơ đồ nghiên cứu (hình 2.1) như sau:
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu
2.6.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.6.2.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Xử lí sơ bộ thân cây Củ mài bằng cách: rửa xà phòng dưới vòi nước chảy, rửa lại bằng nước cất khử trùng trong buồng cấy vô trùng, lắc mẫu trong etanol 70% (v/v)/ 5 phút + nước cất khử trùng 2-3 lần, tiếp đến khử trùng bằng dung dịch Javen 3-9% trong 5-10 phút theo bảng 2.1
Cuối cùng, thân được rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng trước khi cấy lên môi trường cơ bản MS có 30g/l saccharose, 7g/l agar.
Đánh giá thí nghiệm sau 2 tuần theo dõi dựa trên tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sạch sống, tỉ lệ mẫu sạch chết ở từng công thức.
Cây củ mài ngoài tự nhiên Tạo vật liệu khởi đầu - khử
trùng thân non
Nhân nhanh chồi in vitro
Tạo rễ - hình thành cây
in vitro hoàn chỉnh
Rèn luyện cây in vitro ngoài
Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Củ mài
Công thức Chất xử lý/ thời gian
ĐC Xử lý sơ bộ CT1 Xử lý sơ bộ + javen 3%(v/v)/10 phút CT2 Xử lý sơ bộ + javen 7%(v/v)/5phút CT3 Xử lý sơ bộ + javen 7%(v/v)/10 phút CT4 Xử lý sơ bộ + javen 9%(v/v)/10 phút
Đánh giá thí nghiệm sau 15 ngày theo dõi dựa trên các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu nhiểm, tỷ lệ mẫu sạch sống, tỷ lệ mẫu sạch chết.
2.6.2.2. Tái sinh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh của chồi cây Củ mài.
Môi trường nuôi cấy: sử dụng môi trường cơ bản là MS( Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 3% saccharose, chất điều tiết sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau tùy thuộc vào từng thí nghiệm, pH môi trường là 5,8.
Nhiệt độ phòng nuôi cấy được duy trì ở 24- 26°C, cường độ chiếu sáng là 1.800- 2000 lux.
Bố trí thí nghiệm:
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức thí nghiệm tiến hành 3 lần nhắc lại, bố trí 3 bình mẫu. Số liệu được xử lý thống kê.
a, Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi của cây Củ mài.
Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của BAP đến nhân nhanh chồi Củ mài in vitro
Công thức Chất ĐC MScơ bản CT1 BAP 0,1(mg/l) CT2 BAP 0,3(mg/l) CT3 BAP 0,5(mg/l) CT4 BAP 1,0(mg/l) CT5 BAP 1,5(mg/l)
Đánh giá thí nghiệm sau 6 tuần nuôi cấy dựa trên các chỉ tiêu: số chồi, chiều cao chồi, số lá trên chồi và đặc điểm chồi tái sinh.
b, Ảnh hƣởng của BAP kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi của cây Củ mài
Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng của BAP kết hượp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Củ mài
Công thức Chất ĐC MS cơ bản CT1 BAP 0,5(mg/l)+NAA 0,5(mg/l) CT2 BAP 1,0(mg/l)+NAA 0,5(mg/l) CT3 BAP 1,5(mg/l)+NAA 0,5(mg/l) CT4 BAP 2,0(mg/l)+NAA 0,5(mg/l)
Đánh giá thí nghiệm sau 6 tuần nuôi cấy dựa trên các chỉ tiêu: số chồi, chiều cao chồi, số lá trên chồi và đặc điểm chồi tái sinh.
2.6.2.3. Ra rễ tạo cây Củ mài in vitro hoàn chỉnh.
- Các chồi thu được từ thí nghiệm trên được cấy sang môi trường tạo rễ là môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau.
Bảng 2.4: Công thức ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ Củ mài in vitro Công thức Chất CT1 NAA 0,1(mg/l) CT2 NAA 0,2(mg/l) CT3 NAA 0,3(mg/l) CT4 NAA 0,4(mg/l) CT5 NAA 0,5(mg/l)
Theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường thí nghiệm với các chỉ tiêu theo dõi: số rễ, chiều dài rễ.
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức thí nghiệm tiến hành 3 lần nhắc lại, bố trí 3 bình mẫu. Số liệu được xử lý thống kê.
2.6.2.4. Huấn luyện cây Củ màiin vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên nhiên
- Những cây sinh trưởng tốt và có bộ rễ sinh trưởng đồng đều thu được
từ nuôi cấy invitro được chuyển ra ngoài vườn ươm và trồng các loại giá thể
- Bố trí thí nghiệm:
Bảng 2.5: Công thức ảnh hưởng của giá thể tới sự thích nghi của cây Củ mài in vitro ngoài tự nhiên
Công thức Giá thể ĐC 100% đất CT1 Đất thịt nhẹ CT2 Đất cát pha CT3 Đất: cát(1:1) 2.7. Phƣơng pháp thống kê.
Số liệu thực nghiệm được phân tích theo các tham số thống kê gồm trung bình mẫu, độ lệch chuẩn, phân tích thống kê số liệuANOVA 1 yếu tố và kiểm tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phương pháp LSD của Fisher trên phần mềm Excel 2010[15].
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy ngoài tự nhiên vào điều kiện
nuôi cấy in vitro. Đối với mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải xác định
phương thức khử trùng khác nhau cho thích hợp. Thành công của giai đoạn này không chỉ phụ thuộc vào đối tượng cụ thể, cách lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu mà còn phụ thuộc vào chất khử trùng và thời gian khử trùng. Giai đoạn này cần đạt các tiêu chuẩn: tỷ lệ nhiễm khuẩn, nấm thấp và tỷ lệ sống cao, mô tồn tại phân hóa và sinh trưởng tốt. Do đó, việc xác định phương thức khử trùng có ý nghĩa quyết định đối với sự thành công ban đầu và quá trình nhân giống tiếp theo.
Đề tài đã sử dụng thân non cây Củ mài để tạo vật liệu vô trùng. Thân được khử trùng trong javen 3%, 7%, 9% trong thời gian 5, 10 phút sau đó cấy vào môi trường.
Tỷ lệ mẫu sạch khuẩn, nấm trong ống nghiệm là chỉ tiêu đánh giá kết quả khử trùng mẫu. Sau 15 ngày theo dõi kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu đốt thân cây củ mài
C ông thức Chất xử lý/thời gian Tỷ lệ(%) Mẫu nhiễm Mẫu sống Mẫu chết 1 Xử lí sơ bộ 100 0,00 0,00 2 Xử lí sơ bộ +javen 3%(v/v)/10 phút 77,78 22,22 0,00 3 Xử lí sơ bộ+ javen 7%(v/v)/5 phút 55,56 44,44 0,00 4 Xử lí sơ bộ+ javen 7%(v/v)/10 phút 16,67 83,33 0,00 5 Xử lí sơ bộ+ javen 9%(v/v)/10 phút 38,89 38,89 22,22
Theo bảng 3.1 cho thấy mẫu khử trùng ở CT1 đối chứng (xử lý sơ bộ)
không cho hiệu quả khử trùng mẫu in vitro, các mẫu bị nhiễm sau 3-5 ngày
khử trùng với mẫu in vitro. Tuy nhiên có sự khác nhau về hiệu quả, CT4 (xử lí sơ bộ+javen 7%(v/v)/10 phút) cho hiệu quả khử trùng tốt nhất đạt 83,33%.
Supriya Das và cs (2013) khi nghiên cứu trên đối tượng Dioscorea
alata L. đã sử dụng HgCl2 0,1% (w/v) trong thời gian 5 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất [32].
Hình 3.1: Tạo vật liệu khởi đầu A: Thân non cây Củ mài A: Thân non cây Củ mài B:Mẫu Củ mài sạch bệnh.
3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây củ mài.
Sự hình thành và nhân nhanh chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc
tạo ra lượng lớn cây con in vitro, quyết định hiệu quả của quy trình nhân
giống. Quá trình tái sinh và nhân nhanh thường phụ thuộc vào các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là các chất thuộc nhóm cytokinin và trong một số trường hợp là các chất thuộc nhóm auxin và gibberellin ở nồng độ thấp hoặc sự kết hợp giữa chất thuộc nhóm cytokinin với chất thuộc nhóm auxin. Các cytokinin được sử dụng phổ biến là BAP. Các auxin được sử dụng phổ biến là NAA.
Hình 3.2: Tái sinh và nhân nhanh chồi Củ mài in vitro
A: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường B0,1; B: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường B0,3; C: Mẫu nuôi cấy trong môi trường B0,5; D: Mẫu nuôi cấy trong môi trường B0,5+N0.5; E: Mẫu nuôi cấy trong môi trường B1,5+ N0,5; F: Mẫu nuôi cấy trong môi trường B2,0+ N0,5.
3.2.1. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi
BAP là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến trong nhân nhanh chồi. Việc bổ sung BAP vào môi trường nuôi cấy không những làm
tăng kích thước của tế bào mà nó còn kích thích quá trình trao đổi chất [8].
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP (0,1-1,5 mg/l) lên khả năng nhân chồi của Củ mài được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng3.2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6 tuần nuôi cấy
CT Số
chồi/mẫu Số lá/ chồi
Chiều cao chồi(cm)
Đặc điểm chồi tái sinh
ĐC 1,50± 0,55a 6,50 ± 1,05b 5,65 ± 0,50c
Thân màu tía, cao, lá to, màu xanh
đậm
B0,1 3,83± 0,75c 2,17 ± 0,75a 2.10 ± 0,26a
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
B0,3 5,00± 0,89d 2,50 ± 0,55a 3.22 ± 0,21b
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
B0,5 2,50 ± 0,55b 2,17 ± 0,41a 2,23 ± 0,56a
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
B1,0 2,67± 0,82b 2,83 ± 0,75a 2.93 ± 0,22b
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
B1,5 3,00± 0,63bc 2,33 ± 0,82a 2.35 ± 0,19a
Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu
xanh nhạt
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05.
Ảnh hưởng của BAP đến số chồi trên mẫu: Kết quả cho thấy BAP đã kích thích sự hình thành chồi. Số lượng chồi đạt tỉ lệ cao nhất 5,00 chồi trên mẫu ở CT B0,3 mg/l, chồi thu được là chồi có thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu xanh nhạt( Hình 3.2b). Tiếp đến CT B0,1 cho số lượng chồi là 3,83 (Hình 3.2a). Ở CT B0.5, B1, B1.5 có số chồi trên mẫu gần như nhau( 2,5, 2,67, 3)
(Hình 3.2c). Tại các công thức bổ sung BAP chồi thu được đều là chồi thân màu tía thấp lá màu xanh nhạt. Tuy nhiên ở công thức đối chứng đặc điểm của chồi tốt hơn, chồi cao, lá màu xanh đậm.
Ảnh hưởng của BAP đến số lá trên chồi và chiều cao chồi: Kết quả thu được cho thấy BAP không ảnh hưởng nhiều tới số lá trên chồi, chiều cao chồi. Giữa các công thức số lá gần như tương đương nhau (2.17, 2.5, 2.17, 2.83, 2.33), chiều cao chồi cũng không có sự sai khác.
Như vậy, khi nghiên cứu ảnh hưởng của BAP (0,1-1,5 mg/l) đến khả
năng nhân chồi in vitro của củ mài chúng tôi đi đến kết luận 0,3 mg/l BAP là
môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất với 5,00 chồi/mẫu. Còn khi không bổ sung BAP(công thức đối chứng) thì chồi đạt được chiều cao tốt nhất 5,65 cm và cho số lá trên chồi, hình thái chồi tốt nhất.
Thankappan (2012) khi nghiên cứu về Dioscorea wallichii cho rằng
môi trường BAP 2 mg/l là thích hợp nhất để tạo chồi với số chồi đạt 2,6 chồi [33].Sở dĩ có sự khác nhau đó có lẽ là do đối tượng nghiên cứu khác nhau.
3.2.2. Ảnh hƣởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi
Các chồi của củ mài được cấy lên môi trường cơ bản MS bổ sung tổ hợp BAP (0,5-2,0 mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA để thăm dò khả năng nhân
nhanh chồi in vitro. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6 tuần nuôi cấy
BAP NAA Số chồi/mẫu Số lá/chồi Chiều cao
chồi(cm)
Đặc điểm chồi tái sinh
0,00 0,00 1,50 ± 0,55a 6,50 ± 1,05c 5,48 ± 0,34d +++ 0,50 0,50 4,50 ± 1,05b 1,67 ±0,82a 1,85 ± 0,39a ++ 1,00 0,05 3,67 ± 0,82b 1,83 ± 0,75a 2,62 ± 0,39a ++ 1,50 0,50 6,83 ± 1,47c 1,50 ± 0,54a 3,83 ± 1,38b ++ 2,00 0,50 1,83 ± 0,75a 3,17 ± 0,75b 4,97 ± 0,72c +
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
+++: Thân màu tía, cao, lá to, màu xanh đậm ++: Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu xanh nhạt + : Thân màu tía, thấp, lá nhỏ, màu tía
Kết quả thu được cho thấy, môi trường kết hợp 1,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA là môi trường thích hợp cho sự hình thành và sinh trưởng của chồi (đạt 6,83 chồi)(Hình 3.2e). Trong khi đó, môi trường MS và môi trường kết hợp 2 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA thì số lượng hình thành chồi thấp (đạt 1,83 chồi) (hình 3.2f)
Theo Behera và cs (2008) sử dụng môi trường MS bổ sung BAP 2,0
mg/l +NAA 0,5 mg/l + acid ascorbic 100 mg/l trên loài Dioscorea hispida với
hệ số nhân nhanh 6 lần [24]. Các kết quả trên cho thấy có sự sai khác với kết quả của tôi đưa ra, nguyên nhân có thể là do vật liệu nuôi cấy là các loài khác nhau.
3.3. Ảnh hƣởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Củ mài in vitro
Tạo rễ là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân nhanh in vitro. Với mục
đích tạo cây con có sức sống cao, đạt tiêu chuẩn ra cây. Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hoá rễ. Những auxin được dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là NAA. Để tăng khả năng ra rễ cho chồi củ mài nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành lấychồi của củ mài thu được từ các thí nghiệm trên tách riêng lẻ và cấy lên môi trường cơ bản MS bổ sung NAA(0,1;0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/l )để
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA lên khả năng nhân chồi của củ mài sau 6 tuần nuôi cấy
Công thức Số rễ/ chồi Chiều dài
rễ(cm) N0,1 5,80 ± 0,84a 8,84 ± 0,27a N0,2 8,00 ± 1,58c 15,14 ± 0,29c N0,3 7,40 ± 1,52bc 14,74 ± 0,46c N0,4 6,00 ± 0,70ab 9,54 ± 0,36b N0,5 5,20 ± 0,84a 9,08 ± 0,19a
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
Hình 3.3: Rễ cây Củ mài in vitro
A: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,1l; B: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,2; C: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,3; D: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,4; E: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường bổ sung NAA 0,5.
Kết quả ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của củ mài được trình bày tại bảng 3.4 cho thấy, môi trường bổ sung 0,2 mg/l NAA là môi trường thích hợp nhất cho quá trình hình thành rễ của củ mài với trung bình là 8,00
rễ/chồi (Hình3.3b); chiều dài rễ đạt giá trị lớn nhất 15,14 cm ở nồng độ 0,2 mg/l. Ở các chồi này rễ phát triển gần như hoàn chỉnh giống với rễ củ mài ngoài tự nhiên, rễ có kích thước lớn, màu trắng. Khi tăng nồng độ lên 0,5 mg/l NAA chúng tôi nhận thấy quá trình phát triển của rễ bị ức chế dẫn đến sự hình thành rễ ít hơn, rễ có kích thước ngắn hơn.
3.4. Huấn luyện cây Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên.
Việc thuần hoá cây ngoài vườn ươm là một khâu quan trọng, đảm bảo cây có tỉ lệ sống cao, sinh trưởng tốt khi đưa cây vào điều kiện sản xuất. Kết