4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.6.1.Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Mẫu cấy được cấy trong bình, mỗi công thức nhắc lại tối thiểu 30 bình, mỗi bình có 1 mẫu.
Gồm các thí nghiệm:
a. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro:
Sử dụng đốt thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ) để khử trùng bề mặt bằng cách rửa sạch dưới vòi nước chảy trong 25 phút, sau đó lắc trong ethanol 70% trong thời gian khác nhau, kí hiệu I 1-9: 2,5; 5,0 hoặc 10 phút kết hợp với xử lý bằng dung dịch javel 5 % (v/v, pha chế bằng dung dịch tẩy rửa chứa NaClO 5,3%) trong 5, 10, hoặc 15 phút. Rửa lại bằng nước cất khử trùng 2-3 lần.
Mẫu được cấy lên môi trường MS có bổ sung 30 g/l saccharose, 7 g/l agar. Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch chết và tỷ lệ sạch sống, tỷ lệ mẫu mẫu nhiễm sau 2 tuần nuôi cấy.
Tỷ lệ sạch chết = (Số mẫu sạch chết/tổng số mẫu sạch) * 100% (%) Tỷ lệ mẫu sạch sống = (Số mẫu sạch sống/tổng số mẫu sạch) * 100% (%)
Tỷ lệ mẫu nhiễm = (Số mẫu nhiễm/tổng số mẫu) * 100% (%)
b. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro
Tái sinh chồi in vitro:
Nuôi cấy đốt thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ) được khử trùng bề mặt trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l saccharose, 7 g/l agar, bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau, kí hiệu SI 1-8: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 và 2,0 mg/l.
17
Theo dõi các chỉ tiêu: Số chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình (cm), số lá trung bình/chồi, đặc điểm của chồi mới tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy.
Số chồi/mẫu = Số chồi mới trên một mẫu
Chiều cao trung bình = (Chiều cao của chồi 1 + chiều cao của chồi 2 + …+ chiều cao của chồi n)/n (Cm)
Số lá trung bình/chồi = (Số lá của chồi 1 + số lá của chồi 2 + …+ số lá của chồi n)/n
Nhân nhanh chồi in vitro:
Sử dụng chồi mới tái sinh cắt thành các đoạn dài 2 cm (chứa mắt ngủ) môi trường MS, 30 g/l saccharose; 7,0 g/l agar, bổ sung BAP riêng lẻ (0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 g/l) hoặc BAP kết hợp với NAA 0,025 hoặc 0,5 (mg/l), kí hiệu từ SM 1-12.
Theo dõi các chỉ tiêu: Số chồi/mẫu, chiều cao chồi (cm) và số lá/chồi sau 5 tuần nuôi cấy.
Số chồi/mẫu = Số chồi mới trên một mẫu
Chiều cao trung bình = (Chiều cao của chồi 1 + chiều cao của chồi 2 + …+ chiều cao của chồi n)/n (Cm)
Số lá trung bình/chồi = (Số lá của chồi 1 + số lá của chồi 2 + …+ số lá của chồi n)/n
c. Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh:
Chồi in vitro có chiều cao 2-3 cm được nuôi cấy trên môi trường ½ MS, 30 g/l saccharose, 7 g/l agar và α-naphthalene acetic acid (NAA): 0,0; 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0 (mg/l). Theo dõi các chỉ tiêu: tỷ lệ ra rễ (%), số rễ/chồi, chiều cao rễ (cm) sau 2 tuần nuôi cấy.
Tỷ lệ ra rễ = (Số chồi ra rễ/tổng số chồi nghiên cứu) * 100%
d. Rèn luyện cây in vitro thích nghi môi trƣờng tự nhiên:
Cây con in vitro có chiều cao 3-4 cm, có từ 3-5 rễ được sử dụng để ươm vào giá thể bên ngoài gồm: TS1 + đất (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1).
18