4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.6.2. Phương pháp xử lí số liệu thống kê
Các chỉ tiêu theo dõi, đánh giá kết quả thí nghiệm sau 5 tuần nuôi cấy đối với giai đoạn tái sinh và nhân nhanh chồi, 2 tuần đối với giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và giai đoạn ra rễ, theo dõi các chỉ tiêu:
1. Tỷ lệ mẫu sạch chết và tỷ lệ sạch sống, tỷ lệ mẫu mẫu nhiễm. 2. Tỷ lệ sống sót (%)
3. Số chồi trên mẫu 4. Số lá trên chồi
5. Chiều cao trung bình chồi được đo bằng thước kẻ. Đối tượng được đặt song song với thước kẻ thẳng, gốc chồi được đặt tương đương với vạch mức 0 cm của thước, ngon chạm tương ứng đến vạch nào thì đó là chiều cao của 1 chồi. Nếu mẫu có nhiều chồi cần đo tất cả các chồi rồi cộng lại chia trung bình.
Số liệu thực nghiệm được phân tích theo các tham số thống kê số liệu ANOVA 1 yếu tố và kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phương pháp LSD của fisher trên phần mềm Excel 2016 [25]. Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình, các chữ theo sau khác nhau a, b, c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05.
19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng ethanol 70% và javel 5% trong các thời gian kết hợp khác nhau, gồm 9 công thức, xác định các ảnh hưởng dựa trên thời gian khử trùng của từng chất kết hợp. Mẫu được cấy trên môi trường MS, agar 7 g/l và saccarozo 30 g/l, pH = 5,8.
Kết quả theo dõi được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu lên quá trình tạo vật liệu khởi đầu.
Công thức
Thời gian xử lý
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu không nhiễm (%) Ethanol 70% (phút) Javen 5% (phút) Mẫu chết Mẫu sống I1 2,5 5 75,0a 0,0b 21,0e I2 10 67,0ab 11,0ab 32,0de I3 15 53,0bc 8,0ab 46,0cd I4 5,0 5 77,0a 17,0ab 22,0e I5 10 33,0cde 26,00ab 66,0abc I6 15 24,0de 22,0ab 75,0ab I7 10,0 5 45,0cd 22,0ab 54,0ab I8 10 20,0e 22,0ab 79,0a I9 15 28,0de 41,0a 71,0ab LSD0,05 19,0 30,0 19,0
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05.
Kết quả cho thấy khử trùng bề mặt bằng ethanol và dung dịch javel là có hiệu quả, phụ thuộc vào thời gian xử lý. Trong đó công thức cho hiệu quả khử trùng tốt nhất là xử lý bằng ethanol trong 10 phút, sau đó xử lý bằng dung dịch javel 5% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch sống cao nhất, đạt 79,0 %. Cụ thể, ở công thức này tỷ lệ mẫu nhiễm là thấp nhất 20%, tỷ lệ mẫu sạch những chết cũng chiếm tỷ lệ thấp nhất 22%, còn tỷ lệ sạch, sống đạt cao nhất là 79,0%. Khi tăng thời gian khử trùng vượt quá 10 phút, tỷ lệ mẫu nhiễm và
20
sạch chết tăng, tỷ lệ sạch sống lại giảm. Sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy, chồi bật ra từ đốt thân, tuy nhiên sớm bị hoại tử.
Hình 3.1. Chồi bật ra từ đốt thân hồng Vân Khôi sau 8 ngày (a) và 14 ngày (b) nuôi cấy trên môi trường MS.
3.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro 3.2.1. Tái sinh chồi in vitro
BAP là loại cytokinin thích hợp nhất để kích thích sự hình thành chồi [30], trong nghiên cứu này, các mẫu sạch chứa mắt ngủ được nuôi cấy lên môi trường MS có bổ sung BAP các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy, việc bổ sung BAP giúp gia tăng số lượng chồi, giúp chồi kéo dài, lá xanh (được thể hiện ở hình 3.2). Ngoài ra, trong môi trường chứa BAP, số chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi và số lá trung bình/chồi cũng được cải thiện, trong đó môi trường chứa BAP 1,0 cho số chồi/mẫu là 2,75, cao rõ rệt so với các CT còn lại. Khi nồng độ BAP cao hơn (BAP 1,25; 1,5 và 1,75 mg/l) có xu hướng phù hợp cho chiều cao chồi, số lá trung bình/chồi. Tuy nhiên nếu tăng nồng độ của BAP lên 2,0 mg/l sẽ ảnh hưởng không tốt đến khả năng tạo chồi, sự phát triển chiều cao cũng như số lá/chồi cụ thể, ở nồng độ BAP 2,0 mg/l số chồi/ mẫu giảm còn 1,5; chiều cao chồi giảm còn 1,25cm và số lá/chồi là 2,75.
Kết quả theo dõi được thể hiện ở bảng 3.2.
a 1 cm
21
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP lên khả năng tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi (sau 5 tuần nuôi cấy).
Công thức BAP
(mg/l) Số chồi/mẫu
Chiều cao chồi trung bình (cm) Số lá trung bình/chồi SI1 0,25 1,50b 1,45c 3,75ab SI2 0,5 2,25ab 1,37c 2,62b SI3 0,75 2,50ab 2,60ab 3,50ab SI4 1,0 2,75a 2,32b 3,37ab SI5 1,25 1,75ab 2,82a 4,00a SI6 1,5 1,50b 2,70a 4,00a SI7 1,75 1,75ab 1,27c 4,25a SI8 2,0 1,50b 1,25c 2,75b LSD0.05 0,98 0,33 1,11
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
22
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP lên khả năng tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi (sau 5 tuần nuôi cấy).
a. hoa hồng Vân Khôi
b-i: tương ứng với các công thức bổ sung BAP từ 0,25-2,00 (mg/l) với bước nhảy nồng độ là 0,25.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Asad (2010), môi trường có chứa BAP là phù hợp để tái sinh chồi từ mắt ngủ trên đốt thân .
3.2.2. Nhân nhanh chồi in vitro.
Môi trường chứa BAP riêng lẻ và BAP kết hợp NAA ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro của hoa hồng Vân Khôi . Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy môi trường MS chứa BAP 2,0 mg/l
23
là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro, cho số chồi/mẫu đạt 6,00; chiều cao chồi (cm) là 4,70 (hình 3.3 d), tiếp theo là mẫu được nuôi cấy trên môi trường BAP 1,5 mg/l hoặc BAP 0,5 mg/l kết hợp NAA 0,025 mg/l cho số chồi/mẫu tương đương nhau, lần lượt là 3,80 và 4,40 (hình 3.3 c và 3.3 e). Môi trường bổ sung BAP 0,5 phù hợp để tạo lá trên chồi tái sinh (số lá/chồi đạt 6,00), tiếp theo là môi trường BAP 1,5 và 2,0 (mg/l) (hình 3.3 a, c, d).
Kết quả theo dõi được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân nhanh chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro (sau 5 tuần nuôi cấy).
Công thức Thành phần bổ sung Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi BAP (mg/l) NAA (mg/l) SM1 0,5 0 1,80c 2,94c 6,00a SM2 1,0 0 1,80c 2,76c 3,40bc SM3 1,5 0 3,80b 3,58b 3,80b SM4 2,0 0 6,00a 4,70a 3,60b SM5 0,5 0,025 4,40b 1,76d 2,00de SM6 1,0 0,025 1,00c 1,60de 2,20cde SM7 1,5 0,025 1,00c 1,38ef 2,20cde SM8 2,0 0,025 1,60c 0,92g 3,00bcd SM9 0,5 0,05 1,20c 1,44ef 1,80de SM10 1,0 0,05 2,00c 1,26f 1,80de SM11 1,5 0,05 1,40c 0,94g 1,60e SM12 2,0 0,05 1,40c 0,44h 2,00de LSD0,05 1,05 0,26 1,16
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
24
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân nhanh chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro (sau 5 tuần nuôi cấy).
a-d: mẫu nuôi cấy trên môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 (mg/l). e-h: mẫu nuôi cấy trên môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 (mg/l) + NAA
0,025 (mg/l)
i-l: mẫu nuôi cấy trên môi trường BAP 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 (mg/l) + NAA 0,5 (mg/l).
Sự hình thành và nhân nhanh chồi in vitro về cơ bản phụ thuộc vào môi trường chứa cytokinin với các nồng độ khác nhau [20], cytokinin giúp phá ngủ của chồi bên và tỷ lệ bật chồi in vitro ở cây Rosa hybrid L. [19]. Kết qủa này cũng phù hợp đối với một số nghiên cứu trên một số giống hồng khác như trên nghiên cứu của Hồ Tân (2006) trên cây hoa hồng Rosa chinensis, Lê Minh Lý trên giống hoa hồng Rosa hybrid.
25
3.3. Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Sự ra rễ của chồi hoa hồng in vitro thường được cảm ứng bởi chất điều hòa thuộc nhóm auxin. Các chất điều hòa này có thể kích hoạt sự hình thành phức hệ tác động trực tiếp lên ARN mã hóa cho các enzym hình thành rễ [31]. Nghiên cứu này sử dụng NAA, quá trình ra rễ của chồi hoa hồng in vitro phụ thuộc vào NAA chứa trong môi trường nuôi cấy (số liệu được thể hiện ở bảng 3.4, hình 3.4), tỷ lệ ra rễ dao động từ 0-75,0 (%), tỷ lệ ra rễ tăng dần khi nồng độ NAA tăng từ 0-0,75 (mg/l), cao nhất ở công thức R4 (NAA 0,75 mg/l) (hình 3.4c). Khi nồng độ NAA tăng lên 1,0 mg/l thì tỷ lệ ra rễ lại giảm, chỉ còn 64,33 %. Ở công thức R4, số rễ/chồi và chiều cao rễ là tốt hơn so với các công thức còn lại, lần lượt 8,00 và 4,82 (cm).
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh (sau 2 tuần nuôi cấy).
Công thức NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/chồi Chiều cao rễ (cm) R1 N0,00 0,00e 0,00d 0,00d R2 N0,25 46,33d 2,75bc 3,20c R3 N0,50 56,66c 4,00b 3,87b R4 N0,75 75,00a 8,00a 4,82a R5 N1,00 64,33b 2,25c 2,85c LSD0,05 1,81 1,31 0,63
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05
26
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh (sau 2 tuần nuôi cấy). a, b, c, d tương ứng với các
công thức bổ sung NAA các nồng độ 0,25; 0,50; 0,75 và 1,00 (mg/l).
3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiên tự nhiên
Việc rèn luyện cây hoa hồng cấy mô là khó khăn do sự mất nước nhanh, nhạy cảm với độ ẩm của chúng [22]. Trong nghiên cứu này, cây in vitro hoàn chỉnh được rửa sạch thạch và ươm vào các giá thể TS1 + đất (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1). Tỷ lệ sống (%) tương đối thấp, lần lượt là 35,5; 68,4 và 43,2 (%) (hình 3.5).
Hình 3.5. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sống sót, hình thành rễ mới trong điều kiện tự nhiên ở cây hồng Vân Khôi .
a, b, c tương ứng với các giá thể: TS1+đất (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1).
27
Hình 3.6. Cây hồng Vân Khôi phát triển ở ngoài tự nhiên trên môi trường TS1 trong 4 tuần (a) và trong 2 tháng (b)
Hình 3.7. Giá thể TS1 của hãng Klasmann-Deilmann (Đức)
28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1) Tạo vật liệu in vitro cho nuôi cấy mô: Đốt thân cây hoa hồng Vân Khôi được khử trùng bề mặt bằng Ethanol 70% trong 10 phút, xử lý tiếp trong dung dịch javel 5% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch sống đạt cao nhất.
2) Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro: Môi trường MS, 30 g/l saccharose, 7 g/l agar, có bổ sung BAP là phù hợp để bật chồi từ mắt ngủ ở hoa hồng, trong đó nồng độ BAP thích hợp nhất là 1,0 mg/l nhất. Môi trường MS, 30 g/l saccharose, 7 g/l agar, có bổ sung BAP 2,0 (mg/l) là môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro, cho số chồi/mẫu đạt 6,00; chiều cao chồi là 4,70 (cm) sau 5 tuần nuôi cấy. 3) Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh: Môi trường ½ MS, 30 g/l saccharose,
7 g/l agar, bổ sung NAA (0,75 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, tỷ lệ hình thành rễ cao nhất, đạt 75,0%.
4) Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: Cây con được trồng trên giá thể hỗn hợp TS1 cho tỷ lệ sống sót cao nhất 68,4% sau 2 tuần rèn luyện.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu để tìm ra giá thể phù hợp cho tỷ lệ sống cao hơn. Đưa quy trình vào sản xuất tạo cây hoa hồng in vitro.
29
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải, Phạm Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Thuỳ Linh, Đặng Thị Thanh Tâm, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thuỷ (2015), “Nhân nhanh và cảm ứng ra hoa cây hoa hồng cơm (Rosa sericea lindl)”, Tạp chí khoa học và phát triển, 13(4), 606-613.
2. Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Yến (2012), “Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng định hướng rễ ở cây hồng môn và cây cúc nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Sinh học, 34(3), 377-388.
3. Việt Chương, Lâm Thị Mỹ Hương (2006), “Kỹ thuật giâm, chiết, ghép hoa hồng”, NXB Thành phố Hồ Chí Minh.
4. Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, Nguyễn Quang Thạch (2002), “Cây hoa hồng và Kĩ thuật trồng”, Nhà xuất bản Lao động xã hội.
5. Đồng Huy Giới, Bùi Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Trang, Hồ Thị Quyên (2017), “Nhân nuôi cây hoa hồng cổ SaPa (Rosa gallica L.) bằng kỹ thuật cấy mô in vitro”, Hội nghị Khoa học toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ 7, 1229-1235.
6. Đồng Huy Giới, Dương Thị Mến (2017), “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nuôi cấy mô Hồng cổ Sapa”, Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, 5(78), 59-65.
7. La Việt Hồng, Nguyễn Văn Mã, Ong Xuân Phong (2013), “Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật”, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
8. Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ, Trần Trọng Tuấn (2018), “Nghiên cứu nhân giống vô tính và ra hoa in vitro cây hoa hồng tỉ muội (Rosa chinensis Jacq. var Minima Redh)”, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 1392-1397.
9. Mai Thị Ngoan (2009), “Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, phát triển của 1 số giống hoa hồng (Rosa indica L.) nhập nội và ảnh hưởng của biện pháp cắt tỉa, xử lí chế Phẩm đến năng suất và chất lượng hoa hồng VR41 tại Gia Lâm- Hà Nội”, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà nội.
30
10. Nguyễn Thị Kim Thanh (2005), “Nhân giống cây hoa hồng bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 1, 39-41.
11. Cao Thị Thanh (2007), “Phân tích tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cấp độ nông hộ tại thành phố Đà Lạt”, Luận văn thạc sĩ Kinh tế, Bộ giáo dục và đào tạo, Trường đại học Kinh tế thành phố Hồ Chí Minh.
12. Nguyễn Quang Thạch (2000), “Trồng hoa xuất khẩu ở miền Bắc, cơ hội và thách thức”, Tạp chí Khoa học và Tổ quốc, (12).
Tài liệu tiếng Anh
13. Alsemaan T. (2013), “Micropropagation of Damask Rose (Rosa damascena Mill.) cv.”, Almarah, International Journal of Agricultural Research, 8(4), 172-177.
14. Asad S., Hameed N., Ali A., bajwa R., Vecherko N.A., Mursalieva VK (2010), “Factors affecting the growth and development of roses in vitro”,
Biotechnol. Theo. Prac, 1, 41-52.
15. Attia O., Attia, E. L., Dessoky S., Dessoky and Adel E. (2012), “In vitro propagation of Rosa hybrida L. cv. Al-Taif Rose plant”, African Journal of Biotechnology Vol, 11(48), 10888-10893
16. Evans A. (2009) “Rose imports”, Floraculture Intl, 19, 42-43.
17. Hameed N., Shabbir A., Ali A., bajwa R. (2006), “In vitro micropropagation of disease free rose (Rosa indica L.)”, Mycopath, 4(2), 35- 38.
18. Hartmann H. T., Kester D. E., Davies J. F. T., Geneve R. L. (2007), “Plant Hormones In: Plant Propagation: Principle and Practices”, 7th edition, Prentice-Hall,New Delhi, 292-320.
19. Kapchina A. V., Vanntelgen H. J., Yakimova E. (2000), “Role of phenylurea cytokinin CPPU in apical dominance release in in vitro cultured
Rosahybrida L.”, J. Plant Growth Regul, 19, 232-237.
20. Kim C. J. U., Jee S. O., Chung J. D. (2003), “In vitro micropropagation of Rosa hybrida L.”, J. Plant Biotechnol, 5, 115-119.
21. Kumud S., Hem1 P., Vijay R. (2015), “Micropropagation of rose cultivars: biotechnological application to floriculture”, J. Environ. Res. Develop, 10(1), 40-46.
31
22. Messeguer J., Mele E. (1986), “Acclimatization of in vitro
micropropagated roses. In: Somers DA, Gegenbrach BG, Biesboer DD, Hackett WP, Grenn CE, editors. Abstracts of the VI international congress of plant tissue and cell culture”, Univ Minnesota, 236.
23. Murashige T., Skoog F. (1962) “A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, 15, 473-497.
24. Naphaporn N. U., Kantamaht K. and Kamnoon K. (2009),
“Micropropagation from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrida L. cv. Perfume Delight)”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 31 (6), 583-586.
25. Norton M. E., Boe A. (1982), “In vitro propagation of ornamental Rosaceous plants”, Hort, Sci, 17, 190-191.
26. Omidi M., Yadollahi A., Eftekhari M. (2016), “Comparative study of Rosa damascenes Mill. And R. Gallica micro-propagation”, Biological Forum-An International Journal, 8(1), 135 -145.
27. Pati P. K., Rath S. P., Sharma M., Sood A., Ahuja P.S. (2006), “In vitro propagation of rose-a review”, Biotechnology Advances, 24, 94-114.
28. Rajeshbabu P. M., Gopalakrishnan Janarthanan B., Sekar T. (2014), “An