4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.4. Rèn luyện cây invitro thích nghi với điều kiên tự nhiên
Việc rèn luyện cây hoa hồng cấy mô là khó khăn do sự mất nước nhanh, nhạy cảm với độ ẩm của chúng [22]. Trong nghiên cứu này, cây in vitro hoàn chỉnh được rửa sạch thạch và ươm vào các giá thể TS1 + đất (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1). Tỷ lệ sống (%) tương đối thấp, lần lượt là 35,5; 68,4 và 43,2 (%) (hình 3.5).
Hình 3.5. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sống sót, hình thành rễ mới trong điều kiện tự nhiên ở cây hồng Vân Khôi .
a, b, c tương ứng với các giá thể: TS1+đất (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1).
27
Hình 3.6. Cây hồng Vân Khôi phát triển ở ngoài tự nhiên trên môi trường TS1 trong 4 tuần (a) và trong 2 tháng (b)
Hình 3.7. Giá thể TS1 của hãng Klasmann-Deilmann (Đức)
28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1) Tạo vật liệu in vitro cho nuôi cấy mô: Đốt thân cây hoa hồng Vân Khôi được khử trùng bề mặt bằng Ethanol 70% trong 10 phút, xử lý tiếp trong dung dịch javel 5% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch sống đạt cao nhất.
2) Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro: Môi trường MS, 30 g/l saccharose, 7 g/l agar, có bổ sung BAP là phù hợp để bật chồi từ mắt ngủ ở hoa hồng, trong đó nồng độ BAP thích hợp nhất là 1,0 mg/l nhất. Môi trường MS, 30 g/l saccharose, 7 g/l agar, có bổ sung BAP 2,0 (mg/l) là môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro, cho số chồi/mẫu đạt 6,00; chiều cao chồi là 4,70 (cm) sau 5 tuần nuôi cấy. 3) Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh: Môi trường ½ MS, 30 g/l saccharose,
7 g/l agar, bổ sung NAA (0,75 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, tỷ lệ hình thành rễ cao nhất, đạt 75,0%.
4) Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: Cây con được trồng trên giá thể hỗn hợp TS1 cho tỷ lệ sống sót cao nhất 68,4% sau 2 tuần rèn luyện.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu để tìm ra giá thể phù hợp cho tỷ lệ sống cao hơn. Đưa quy trình vào sản xuất tạo cây hoa hồng in vitro.
29
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải, Phạm Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Thuỳ Linh, Đặng Thị Thanh Tâm, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thuỷ (2015), “Nhân nhanh và cảm ứng ra hoa cây hoa hồng cơm (Rosa sericea lindl)”, Tạp chí khoa học và phát triển, 13(4), 606-613.
2. Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Yến (2012), “Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng định hướng rễ ở cây hồng môn và cây cúc nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Sinh học, 34(3), 377-388.
3. Việt Chương, Lâm Thị Mỹ Hương (2006), “Kỹ thuật giâm, chiết, ghép hoa hồng”, NXB Thành phố Hồ Chí Minh.
4. Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, Nguyễn Quang Thạch (2002), “Cây hoa hồng và Kĩ thuật trồng”, Nhà xuất bản Lao động xã hội.
5. Đồng Huy Giới, Bùi Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Trang, Hồ Thị Quyên (2017), “Nhân nuôi cây hoa hồng cổ SaPa (Rosa gallica L.) bằng kỹ thuật cấy mô in vitro”, Hội nghị Khoa học toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ 7, 1229-1235.
6. Đồng Huy Giới, Dương Thị Mến (2017), “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nuôi cấy mô Hồng cổ Sapa”, Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, 5(78), 59-65.
7. La Việt Hồng, Nguyễn Văn Mã, Ong Xuân Phong (2013), “Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật”, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
8. Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ, Trần Trọng Tuấn (2018), “Nghiên cứu nhân giống vô tính và ra hoa in vitro cây hoa hồng tỉ muội (Rosa chinensis Jacq. var Minima Redh)”, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 1392-1397.
9. Mai Thị Ngoan (2009), “Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, phát triển của 1 số giống hoa hồng (Rosa indica L.) nhập nội và ảnh hưởng của biện pháp cắt tỉa, xử lí chế Phẩm đến năng suất và chất lượng hoa hồng VR41 tại Gia Lâm- Hà Nội”, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà nội.
30
10. Nguyễn Thị Kim Thanh (2005), “Nhân giống cây hoa hồng bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 1, 39-41.
11. Cao Thị Thanh (2007), “Phân tích tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cấp độ nông hộ tại thành phố Đà Lạt”, Luận văn thạc sĩ Kinh tế, Bộ giáo dục và đào tạo, Trường đại học Kinh tế thành phố Hồ Chí Minh.
12. Nguyễn Quang Thạch (2000), “Trồng hoa xuất khẩu ở miền Bắc, cơ hội và thách thức”, Tạp chí Khoa học và Tổ quốc, (12).
Tài liệu tiếng Anh
13. Alsemaan T. (2013), “Micropropagation of Damask Rose (Rosa damascena Mill.) cv.”, Almarah, International Journal of Agricultural Research, 8(4), 172-177.
14. Asad S., Hameed N., Ali A., bajwa R., Vecherko N.A., Mursalieva VK (2010), “Factors affecting the growth and development of roses in vitro”,
Biotechnol. Theo. Prac, 1, 41-52.
15. Attia O., Attia, E. L., Dessoky S., Dessoky and Adel E. (2012), “In vitro propagation of Rosa hybrida L. cv. Al-Taif Rose plant”, African Journal of Biotechnology Vol, 11(48), 10888-10893
16. Evans A. (2009) “Rose imports”, Floraculture Intl, 19, 42-43.
17. Hameed N., Shabbir A., Ali A., bajwa R. (2006), “In vitro micropropagation of disease free rose (Rosa indica L.)”, Mycopath, 4(2), 35- 38.
18. Hartmann H. T., Kester D. E., Davies J. F. T., Geneve R. L. (2007), “Plant Hormones In: Plant Propagation: Principle and Practices”, 7th edition, Prentice-Hall,New Delhi, 292-320.
19. Kapchina A. V., Vanntelgen H. J., Yakimova E. (2000), “Role of phenylurea cytokinin CPPU in apical dominance release in in vitro cultured
Rosahybrida L.”, J. Plant Growth Regul, 19, 232-237.
20. Kim C. J. U., Jee S. O., Chung J. D. (2003), “In vitro micropropagation of Rosa hybrida L.”, J. Plant Biotechnol, 5, 115-119.
21. Kumud S., Hem1 P., Vijay R. (2015), “Micropropagation of rose cultivars: biotechnological application to floriculture”, J. Environ. Res. Develop, 10(1), 40-46.
31
22. Messeguer J., Mele E. (1986), “Acclimatization of in vitro
micropropagated roses. In: Somers DA, Gegenbrach BG, Biesboer DD, Hackett WP, Grenn CE, editors. Abstracts of the VI international congress of plant tissue and cell culture”, Univ Minnesota, 236.
23. Murashige T., Skoog F. (1962) “A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, 15, 473-497.
24. Naphaporn N. U., Kantamaht K. and Kamnoon K. (2009),
“Micropropagation from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrida L. cv. Perfume Delight)”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 31 (6), 583-586.
25. Norton M. E., Boe A. (1982), “In vitro propagation of ornamental Rosaceous plants”, Hort, Sci, 17, 190-191.
26. Omidi M., Yadollahi A., Eftekhari M. (2016), “Comparative study of Rosa damascenes Mill. And R. Gallica micro-propagation”, Biological Forum-An International Journal, 8(1), 135 -145.
27. Pati P. K., Rath S. P., Sharma M., Sood A., Ahuja P.S. (2006), “In vitro propagation of rose-a review”, Biotechnology Advances, 24, 94-114.
28. Rajeshbabu P. M., Gopalakrishnan Janarthanan B., Sekar T. (2014), “An efficient and rapid generation protocol for micropagation of rose bourboniana from nodal explants”, International Journal of Current Biotechnology, 2(1), 24-29.
29. Shabbir A., Hameed N., AlI A. and bajwa R. (2009), “Effect of different cultural conditionson micropropagation of rose (Rose indica L.)”, Pakitans Journal of biological Sciences, 41 (6), 2877-2882.
30. Vijaya N., Satyanarayana G., Prakash J., Pierik R.L.M. (1991), “Effect of culture media and Growth Regulators on in vitro Propagation of rose”,
Curr. Plant Sci. Biotechnol. Agric, 12, 209-214.
31. Vu N. H., Anh P. H., Nhut D. T. (2006), “The role of sucrose and different Cytokinin in the in vitro floral morphogenesis of rose (Hybrid tea) cv.”, First Prize, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 87, 315-320.
32. Wang G. Y., Yuan M. F., Hong Y. (2002), “In vitro flower induction in roses”, In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 38: 513-518.
32
33. Zeng S. J., Liang S., Zhang Y., Wu K.. L., Teixeirdasilva J. A., Duan J. (2013), “In vitro flowering red miniature rose”, Biologia Plantarum, 57(3), 401-409.
Tài liệu Internet
34. https://www.baotintuc.vn/kinh-te/phat-trien-thuong-hieu-hoa-hong-tai- me-linh-ha-noi-20141115213105211.htm. 35. https://vuonhoaviet.vn/mua-ban-hoa-hong-co-bach-van-khoi-o-dau-uy- tin-chat-luong. 36. https://vi.wikipedia.org/wiki/hoa_h%E1%BB%93ng. 37. http://www.thv.vn/ha-noi-phat-trien-thuong-hieu-hoa-hong-gan-voi-vung- dat-me-linh-e3987.html. 38. http://ceford.vn/tin-tuc/tinh-hinh-san-xuat-hoa-cay-canh-the-gioi-2017
39. PHỤ LỤC
Môi trường MS là tên của loại môi trường tổng hợp được pha sẵn, là tên viết tắt của Murashige and Skoog medium, được phát minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio Murashige và Skoog Folke K. vào năm 1962 khi Murashige đang tìm kiếm một loại hormone mới.
Bảng thành phần môi trường MS Khoáng vi lượng µM CoCl2.6H2O 0.11 CuSO4.5H2O 0.10 FeNaEDTA 100.00 H3BO3 100.27 KI 5.00 MnSO4.H2O 100.00 Na2MoO4.2H2O 1.03 ZnSO4.7H2O 29.91
Khoáng đa lượng µM
CaCl2 2.99 KH2PO4 1.25 KNO3 18.79 MgSO4 1.50 NH4NO3 20.61 Vitamins µM Glycine 26.64 myo-Inositol 554.94 Nicotinic acid 4.06 Pyridoxine HCl 2.43 Thiamine HCl 0.30
133
HNUE JOURNAL OF SCIENCE DOI: 10.18173/2354-1059.2019-0016
Natural Sciences 2019, Volume 64, Issue 3, pp. 133-140 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn
NHÂN GIỐNG CÂY HOA HỒNG VÂN KHÔI (Rosa “Souvenir de la malmaison”) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ
La Việt Hồng1, Chu Đức Hà2, Trần Thị Thanh Huyền3, Lê Thị Lâm1 và Mai Thị Hồng1
1Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
2Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
Tóm tắt. Trong nghiên cứu này, gi ng hoa hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir de la
malmaison ợc sử dụng làm vật liệu cho thuật nu i c y m ết quả cho th y, t
thân cây hoa hồng Vân h i ợc khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 10 phút, xử lý tiếp trong dung dịch javel 5% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch s ng ạt 79, Đ c ịnh ợc c ng thức m i tr ờng MS, 3 g/l saccarozơ, 7 g/l agar, có bổ sung 1,0 mg/l BAP là phù hợp nh t ể bật chồi từ mắt ngủ ở hoa hồng. M i tr ờng t ơng tự nh ng bổ sung BAP 2,0 mg/l là thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro, s chồi trung bình/mẫu ạt 6, v i chiều cao trung bình chồi là 4,7 (cm) sau 5 tuần nuôi c y Tiếp theo, c ịnh ợc c ng thức m i tr ờng MS có bổ sung NAA 0,75 mg/l thích hợp cho tạo rễ in vitro v i tỷ lệ hình thành rễ cao nh t ạt 75, Cây con ợc trồng trên giá thể hỗn hợp TS1 cho tỷ lệ s ng sót cao nh t ạt 68,4% sau 2 tuần rèn luyện.
Từ khóa: c y m , hoa hồng, thuật, nhân gi ng, Vân h i
1. Mở đầu
Hoa hồng là một trong những loại hoa th ơng mại quan trọng của ngành công nghiệp hoa thế gi i [1]. Hoa hồng ợc yêu thích do có nhiều hình d ng, ích th c, màu sắc h c nhau Đặc biệt hoa còn có mùi thơm, nên hoa hồng còn ợc trồng ể sản xu t các loại tinh dầu, vitamin C, ây chính là lý do mà hoa hồng ợc mệnh danh “nữ hoàng của các loài hoa [2] Trong s ó, hoa hồng Vân Khôi (Rosa “Souvenir De la Malmaison” là gi ng hồng cổ của h p, có ặc iểm bông to màu hồng ph n, mùi thơm dễ chịu Đây ợc em là dòng hồng bụi hiếm, ợc r t nhiều ng ời yêu chuộng. Cây hoa hồng th ờng ợc nhân gi ng vô tính bằng c c ph ơng ph p nh giâm hom, chiết và gh p Tuy nhiên, c c ph ơng ph p này th ờng òi h i thời gian và c ng lao ộng trong hi hiệu quả thành c ng h ng cao, ặc biệt là i v i các gi ng hồng ngoại nhập. Hơn nữa, cây gi ng ợc nhân lên bằng ph ơng ph p truyền th ng cũng th ờng xuyên bị nhiễm bệnh, từ ó ảnh h ởng t i sản l ợng và ch t l ợng hoa [3].
Nuôi c y mô thực vật là k thuật ợc sử dụng r t rộng rãi trong nông nghiệp hiện ại, là công cụ tiềm năng giúp nhân nhanh và hiệu quả i v i nhiều loại thực vật. Ở Việt Nam, có một s công b nhân gi ng thành công cây hoa hồng cổ SaPa bằng ph ơng ph p nu i c y mô [4], nhân gi ng và cảm ứng ra hoa trong ng nghiệm ở cây hồng cơm [5], cây hồng tỉ muội [6] Đến nay ch a có b t kỳ công b nào ợc thực hiện trên i t ợng cây hoa hồng Vân Khôi.
Ngày nhận bài: 27/12/2018. Ngày sửa bài: 19/3/2019. Ngày nhận ăng: 26/3/2019. Tác giả liên hệ: Trần Thị Thanh Huyền Địa chỉ e-mail: tranthanhhuyen@hnue.edu.vn
La Việt Hồng, Chu Đức Hà, Trần Thị Thanh Huyền, Lê Thị Lâmvà Mai Thị Hồng
134
2. Nội dung nghiên cứu
2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Cây hoa hồng Vân h i 1 năm tuổi thu thập tại huyện Mộc Châu - tỉnh Sơn La ợc trồng tại v ờn thực nghiệm sinh học, hoa Sinh - thuật n ng nghiệp, Đại học S phạm Hà Nội 2.
Giá thể t ợc cung c p bởi hãng Klasmann-Deilmann (Đức).
2.1.2.Phương pháp nghiên cứu
* Tạo vật liệu khởi đầu in vitro:
Sử dụng t thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ) ể khử trùng bề mặt bằng cách rửa sạch d i vòi n c chảy, sau ó lắc trong cồn 70% trong 2,5-5,0-10 phút kết hợp v i xử lý bằng dung dịch javel 5% trong 5-10-15 phút. Rửa lại bằng n c c t khử trùng 2-3 lần. Mẫu ợc c y lên m i tr ờng Murashige và Skoog (MS) có bổ sung 3 g/l saccarozơ, 7 g/l agar Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch, mẫu nhiễm sau 2 tuần nuôi c y.
* Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro:
Tái sinh chồi in vitro: nuôi c y t thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ ợc khử trùng bề mặt
trên m i tr ờng MS [7] có bổ sung 3 g/l saccarozơ, 7 g/l agar, bổ sung 6-benzylaminopurine (BAP) nồng ộ khác nhau, kí hiệu SI 1÷8; t ơng ứng v i các nồng ộ ,25- ,5- ,75-1, -1,25-1,5- 1,75-2, mg/l Theo dõi và c ịnh các chỉ tiêu, bao gồm s chồi trung bình/mẫu, chiều cao chồi trung bình (cm và s lá trung bình/chồi sau 5 tuần nuôi c y.
Nhân nhanh chồi in vitro:
Sử dụng chồi m i tái sinh cắt thành c c oạn dài 2 cm (chứa mắt ngủ ặt trên m i tr ờng MS chứa 3 g/l saccarozơ, 7, g/l agar, bổ sung BAP riêng lẻ (0,5-1,0-1,5-2,0 g/l) hoặc kết hợp v i α-naphthalene acetic acid (NAA) 0,25-0,5 (mg/l), kí hiệu c c c ng thức từ SM1-12 Theo dõi và c ịnh các chỉ tiêu bao gồm s chồi trung bình/mẫu, chiều cao chồi trung bình (cm và s l trung bình/chồi sau 5 tuần nuôi c y.
* Tạo cây in vitro hoàn chỉnh:
Chồi in vitro có chiều cao 2-3 cm ợc nuôi c y trên m i tr ờng MS, 3 g/l saccarozơ, 7 g/l agar và N ở c c nồng ộ -0,25-0,5-0,75-1,0 (mg/l). X c ịnh các chỉ tiêu: tỷ lệ ra rễ trung bình ( , s rễ trung bình/chồi, chiều dài rễ trung bình (cm sau 2 tuần nuôi c y.
* Rèn luyện cây in vitro thích nghi môi trường tự nhiên:
Cây con in vitro có chiều cao 3-4 cm, có 3-5 rễ ợc sử dụng ể ơm vào gi thể bên ngoài gồm: TS1+ t (1:1), TS1, TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1) Theo dõi và c ịnh tỷ lệ s ng sót (%) sau 2 tuần thí nghiệm.
* Phân tích thống kê:
S liệu thực nghiệm ợc xử lý theo các tham s th ng kê và kiểm tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng ph ơng ph p LSD của Fisher trên phần mềm Excel 2010 [8]. S liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình ± ộ lệch chuẩn, trong cùng một cột, các chữ theo sau khác nhau a, b, c… thể hiện sự sai h c có ý nghĩa th ng kê v i α = 0,05.
2.2. Kết quả và thảo luận
ế uả ạ nguồn vật liệu khởi đầu
Kết quả cho th y khử trùng bề mặt bằng cồn 70% và dung dịch javel 5% là có hiệu quả, phụ thuộc vào thời gian xử lý Trong ó c ng thức cho hiệu quả khử trùng t t nh t là xử lý bằng
Nhân giống cây hoa hồng vân khôi (Rosa “Souvenir de la malmaison”) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô
135 cồn trong 1 phút, sau ó ử lý bằng dung dịch javel 5% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch s ng cao nh t ạt 79,0% (kết quả thể hiện ở Bảng 1).
Bảng 1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cho nuôi cấy in vitro