3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp chuyển gen vào cây dừa cạn
Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Bùi Thị Hà và cs (2016) [9]. Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm dựa theo các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào cây dừa cạn đã được tối ưu bao gồm: (i) Vật liệu chuyển gen là lá mầm; (ii) Nồng độ vi khuẩn OD600nm= 0,8; (iii) Nồng độ acetosyringone là 100µM; (iv) Thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút; (v) Nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen là 50 mg/ l. Quy trình chuyển gen Prx vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A.
Hình 2.1. Sơ đồ chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens
Chọn lọc chồi chuyển gen
Chọn lọc chồi trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l
Tái sinh chồi chuyển gen
Chồi sống sót được tái sinh trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l
Tạo cây hoàn chỉnh và ra cây
- Chồi tái sinh được chuyển sang môi trường ra rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l. - Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Chuẩn bị vật liệu chuyển gen
- Gieo hạt tạo cây con in vitro - Thu lá mầm 10 – 14 ngày tuổi Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens với mật độ OD600nm = 0,8 Chuyển gen
- Lá mầm được nhiễm khuẩn trong thời gian 30 phút + AS 100 µM
- Đồng nuôi cấy 3 ngày trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 3,9g/ l + muối B5 0,3g/ l + AS 100µM
Bảng 2.1. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với Dừa cạn Loại môi trường Kí hiệu Thành phần Nảy mầm hạt (Germination medium) GM
MS cơ bản + sucrose 30 g/ l + agar 9 g/ l, pH = 5,8
Đồng nuôi cấy (Co-cultivation medium)
CCM
MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,39g/ l + muối B5 0,3g/ l + AS 100 µM Cảm ứng tạo đa chồi (Shoot induction medium) SIM
MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l
Kéo dài chồi (Shoot
elongation medium)
SEM
MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l Ra rễ (Rooting medium) RM
MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l
Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường Thành phần
LB lỏng Bacto pepton 10 g/ l + NaCl 10 g/ l + Yeast Extract 5 g/ l, pH = 7
2.3.1.1. Nguyên liệu biến nạp
Khử trùng hạt bằng cồn 70% lắc trong 1 phút. Sau đó ngâm hạt trong dung dịch nước tẩy (Javel 60%) lắc trong 15 phút. Loại bỏ dung dịch nước tẩy và rửa hạt bằng nước cất khử trùng. Hạt dừa cạn sau khi khử trùng cho nảy mầm trên môi trường MS cơ bản. Sau 10 – 14 ngày cây con phát triển, lá được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng, sử dụng làm nguyên liệu biến nạp gen và nuôi cấy in vitro.
2.3.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm
Cấy trải A. tumefaciens cất giữ trong glycerol lên đĩa môi trường LB
đặc có bổ sung kanamycin 50 mg/ l và rifamicin 50 mg/ l, nuôi ở 28oC
trong 48 - 96 giờ. Sau đó, lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi
trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin và nuôi lắc với tốc độ
220 vòng/ phút ở 28oC trong 16 – 18 giờ. Lấy 1ml dịch vi khuẩn nuôi hoạt
hóa trong 10ml LB lỏng ở tốc độ 220 vòng/ phút ở 28oC trong 3 – 4 giờ.
Lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy lần 2 ly tâm với tốc độ 5000 vòng/
phút, ở 4oC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi trường
1/ 2 MS và pha loãng cho tới mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm = 0,8.
2.3.1.3. Lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Các mảnh lá mầm dừa cạn được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 3 – 4 lần vào phần nách lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100µM, trong 30 phút sau đó thấm khô. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian 3 ngày.
2.3.1.4 . Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được rửa trong môi trường 1/ 2 MS có bổ sung cefotaxim 500 mg/ l với thời gian là 10 phút,
sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo cảm ứng đa chồi (SIM) có bổ sung kanamycin 50 mg/ l.
2.3.1.5. Kéo dài chồi
Sau 4 tuần, các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn lọc được loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM).
2.3.1.6. Tạo rễ
Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 2 – 3cm sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ (RM) để tạo cây hoàn chỉnh.
2.3.1.7. Cây ra môi trường tự nhiên
Cây con có chiều cao 8 – 10 cm và rễ đạt từ 5 – 7 cm được đưa ra giá thể, để nơi tránh ánh sáng trực tiếp. Sau 1 tuần có thể tưới cây bằng dung dịch MS với tỷ lệ 1/ 10, ngày 1 lần. Sau 2 đến 3 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra môi trường.
2.3.2. Phân tích cây chuyển gen
2.3.2.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR
Tách chiết DNA tổng số từ lá cây dừa cạn chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 35S để xác định sự có mặt của gen crPrx với thành phần ở bảng 2.5 theo chu trình nhiệt các bước ở bảng 2.6. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Trình tự mồi 35S:
F: 5’ – CAA CGT CTT CAA AGC AAG TGG – 3’
R: 5’ – TTC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C – 3’
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
- Cân 200 mg mẫu lá và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển vào ống E ppendorf 2 ml.
- Bổ sung 1 ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống Eppendorf 2 ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 12000 vòng/ phút (v/ p) trong 7 phút ở 4oC.
- Loại di ̣ch nổi và lă ̣p la ̣i bước 2 – 3 từ 1 đến 2 lần.
- Bổ sung 0,8 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phú t đến 1 tiếng.
- Giữ mẫu ở nhiệt đô ̣ phòng trong thời gian 10 phút.
- Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều trong thờ i gian 10 phút. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC.
- Hút dịch nổi cho vào ống Eppendorf 1,5 ml mới.
- Bổ sung mô ̣t thể tích tương đương isopropanol (la ̣nh), đảo nhẹ, để ở đá trong 30 phút. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC.
- Loại bỏ dịch nổi thu tủa, bổ sung 0,5 ml cồn 80%. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 4 phút ở 4oC (bướ c này thực hiê ̣n 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol.
- Làm khô DNA bằ ng quạt gió , máy hút chân không.
- Hòa tan DNA trong 100 µl nước khử ion. Bổ sung 3 µl RNase (10 mg/ ml) ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Bảng 2.3 : Hóa chất pha đê ̣m rửa
STT Hó a chất Nồ ng độ stock
Nồ ng độ sử du ̣ng Thể tích
1 Tris- HCl pH 8 1 M 100 mM 5 ml
2 EDTA pH 8 0,5 M 5 mM 0,5 ml
3 Sorbitol Bột 0,35 M 3,1885 g
4 NaH2PO4 Bột 0,4% 0,5 g
Thêm nước đến thể tích cuối cùng là 50 ml 50 ml
Bảng 2.4: Hóa chất pha đê ̣m chiết
STT Hó a chất Nồ ng độ stock
Nồ ng độ sử dụng Thể tích 1 CTAB Bột 2% 0,5 g 2 NaCl 5 M 1,4 M 7 ml 3 EDTA pH 8 0,5 M 20 mM 1 ml 4 Tris- HCl pH 8 1 M 100 mM 2,5 ml 5 β -MercaptoEthanol 0,1% 25 µl
Thêm nước đến thể tích cuối cùng 25 ml 25 ml
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S
STT Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
1 H2O - 10
2 Master mix 2X 12,5
3 Mồi xuôi 10 pmol/ µl 1
4 Mồi ngược 10 pmol/ µl 1
5 AND/ cDNA 100 ng/ µl 0,5
Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 5 phút
30
2 Biến tính 94 30 giây
3 Gắn mồi 56 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút
6 Kết thúc phản ứng 15 ∞
Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45 – 50oC đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn. Sau 30 phú t khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5 – 1 cm.
- Tra mẫu: Sản phẩm PCR tra vào các giếng trên gel.
- Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn. Đặt 120V, 90mA, 30 phút.
- Nhuộm bản gel trong dung dịch ethibium trong 15 phú t.
- Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr.
- Chụp ảnh gel.
2.3.2.3. Các phương pháp phân tích xử lý số liệu
Hiệu suất chuyển gen được xác định bằng công thức: Số cây mang gen chuyển
Hiệu suất chuyển gen (%) = x 100 (%) Tổng số mẫu biến nạp
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tạo cây dừa cạn mang gen chuyển crPrx
3.1.1. Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào cây dừa cạn nhờ A. tumefaciens tumefaciens
Hạt dừa cạn được khử trùng bằng cồn 70% lắc trong 1 phút và javen 60% lắc trong 15 phút, sau đó cho nảy mầm trên môi trường MS đến khi cây con phát triển (hình 3.1 A-B), lá mầm được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng để làm vật liệu nhận gen.
A B
C Hình 3.1. Gieo hạt tạo cây con in vitro
A: Gieo hạt dừa cạn trên môi trường MS;
Lá mầm được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100 M trong 30 phút (hình 3.2).
Hình 3.2. Ngâm mảnh lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn
Sau đó thấm khô, cấy trên môi trường môi trường CCM. Nuôi trong tối 3 ngày (hình 3.3).
Hình 3.4. Mẫu được thấm khô và đặt lên môi trường SIM
Hình 3.6. Chọn lọc kéo dài chồi trên SEM
Các chồi nhỏ sống sót kéo dài trên môi trường SEM có kháng sinh chọn lọc kanamycin được chuyển sang môi trường ra rễ RM và sau đó đem trồng lên giá thể (hình 3.7), cây tái sinh được đưa ra môi trường tự nhiên.
Chúng tôi tiến hành biến nạp cấu trúc gen crPrx nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín của cây dừa cạn, các giai đoạn nuôi
cấy và chọn lọc, kết quả như sau: Lá mầm được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600nm = 0,8 bổ sung acetosyringone 100 M trong 30 phút. Sau khi đồng nuôi cấy 3 ngày, chuyển mẫu lên môi trường nuôi cấy để chọn lọc và tái sinh chồi chuyển gen: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l. Các mẫu tạo chồi được đưa sang môi trường chọn lọc như trên để tránh các mẫu chết sản sinh ra các chất làm ức chế tái sinh ở các mẫu tạo chồi. Chồi đạt chiều cao 2 – 3 cm được chuyển sang môi trường ra rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l. Cây con có chiều cao 8 – 10 cm và rễ đạt từ 5 – 7 cm được đưa ra giá thể. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây dừa cạn Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tạo chồi Số cây chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây sống trên giá thể Lần 1 300 100 32 18 7 Lần 2 366 97 33 22 8 ĐC 0* 50 0 0 0 0 ĐC*1 50 18 13 10 5
Ghi chú: * ĐC0 lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh. *ĐC1 lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh
Thí nghiệm chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím qua hai lần biến nạp với 666 mảnh lá mầm (Bảng 3.1) thu được 197 mẫu tạo chồi, 65 mẫu có chồi kéo dài trên môi trường kháng sinh chọn lọc SEM, 40 chồi ra rễ khỏe mạnh và thu được 15 cây T0 phát triển trên giá thể.
Song song với thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn chuyển gen crPrx,
chúng tôi có bố trí hai lô đối chứng là ĐC0 và ĐC1 (mỗi lô 50 mẫu). Kết quả là lô ĐC0 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh bổ sung kháng sinh chọn lọc), các lá mầm đều bị đào thải bởi kháng sinh; lô ĐC1 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy trên tái sinh không bổ sung kháng sinh chọn lọc) thu được 5 cây tái sinh không chuyển gen sử dụng làm đối chứng.
Các cây dừa cạn T0 tái sinh sau lây nhiễm được trồng, chăm sóc ngoài môi trường tự nhiên khoảng 4 tuần thì tiến hành thu mẫu lá để kiểm tra sự có mặt và hoạt động của gen chuyển crPrx.
3.1.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển crPrx trong hệ gen cây dừa cạn
Trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật, có thể nói, một trong những thành công sớm nhất và có giá trị nhất đối với lĩnh vực biểu hiện protein thực vật chính là việc sử dụng các promoter cơ định có nguồn gốc từ virus và vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ biểu hiện gen ngoại lai hiệu quả
trong cây trồng biến đổi gen. Rất nhiều promoter như vậy đã được sử dụng
rộng rãi trong công nghệ gen thực vật và vẫn được tiếp tục là promoter
được chọn lựa trong các nghiên cứu biểu hiện nhanh, đơn giản với rủi ro
thấp. Một trong các promoter được sử dụng rộng rãi để điều khiển biểu
hiện gen ngoại lai trong cây trồng biến đổi gen là 35S. Promoter 35S là
promoter dạng cơ định có khả năng điểu khiển biểu hiện gen ở mức độ cao,
khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô của nhiều loài cây, hoạt động
mạnh ở cả các hệ thống biểu hiện tạm thời và các tế bào chuyển gen thực
vật ổn định [5].
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển crPrx trong cây dừa cạn chuyển gen, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi 35S để khuếch đại gen cần xác định. Tiến hành tách chiết, tinh sạch DNA tổng số từ lá của 15 cây dừa
cạn chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% được thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển
