Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

3. Nội dung nghiên cứu

1.7.Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase chain reaction) được Kary B Mullis phát hiện ra năm 1983. Đây là phương pháp ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA đặc hiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng DNA quan tâm nằm giữa hai mồi bằng cách lặp lại nhiều chu kỳ với các bước biến tính 2 mạch DNA khuôn, bắt cặp các mồi và kéo dài các sợi. Kỹ thuật PCR đơn giản, dễ thực hiện với hầu hết các phòng thí nghiệm được trang bị máy PCR. Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã được biết trình tự, vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành PCR. Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, nếu sản phẩm PCR khi điện di có kích thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì mẫu phân tích được coi là dương tính. Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thành công, vì có nhiều cách để giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A. tumefaciens mang gen chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu phân tích. Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi là dương tính giả. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ. (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính). (3) Gen chuyển không hoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý do trên mà kết quả PCR mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu khi phân tích cây chuyển gen.

Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích phát hiện các mẫu lương thực thực phẩm biến đổi gen (genetic modify origanism-GMO). Để phục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát triển thành kỹ thuật multiplex PCR (MPCR). Với việc sử dụng đồng thời

nhiều cặp mồi nhận biết các gen khác nhau (promoter, teminator, gen chọn lọc, gen đích… ) trong một phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời nhiều trình tự đích nếu mẫu có mang các gen đó. Thông thường các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR là mồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS, EPSPS. Nếu kết quả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần xác định rất có thể đã được chuyển gen.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Hạt cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) hoa hồng tím được thu thập tại vườn trường thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên – tỉnh Thái Nguyên.

2.1.2. Vật liệu di truyền

Vector chuyển gen mang cấu trúc gen crPrx phân lập từ cây dừa cạn hoa hồng tím: pBI121-CrPrx

Vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector pBI121-CrPrx.

2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, NAA, IBA, nước dừa, đường sucrose, thạch agar, ethanol, than hoạt tính…

Bộ Kit dùng cho phản ứng PCR, bộ Kit tinh sạch sản phẩm PCR Accuprep PCR Purification (Bioneer - Hàn Quốc), bộ Kit tách dòng “TA cloning Kit” (hãng Invitrogen), bộ Kit tách plasmid tái tổ hợp “AccuprepTM Plasmid Mini Extraction Kit”, Kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng Bioneer cung cấp.

Thiết bị

Dùng trong nuôi cấy và chuyển gen: bình tam giác 250ml, pipetman, cốc thủy tinh, ca nhựa, đũa thủy tinh, siêu điện, bông, giấy làm nút, giấy thấm. Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, panh cấy, buồng cấy vô trùng Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mỹ), nồi khử trùng (Auto

Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy (Memmerb, Anh), cân điện tử, máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ) và một số thiết bị khác tại Phòng công nghệ DNA ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 09 năm 2015, chuyển gen ở cây dừa cạn được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ tế bào, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, đại học Thái Nguyên.

Thí nghiệm phân tích cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Đề tài nghiên cứu được hoàn thành tại Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa Học, Đại học Thái Nguyên.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nuôi cấy in vitro và chuyển gen vào cây dừa cạn dựa trên “Nghiên cứu quy trình chuyển gen Gus ở cây dừa cạn” của Bùi Thị Hà và cộng sự (2016).[9]

2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro

Thu mẫu và xử lí mẫu: Quả sau khi thu về được phơi khô 2 – 3 ngày, sau đó tách lấy hạt. Cho hạt vào ống falcon 50ml lắc nhiều lần để rửa sạch hạt trước khi tiến hành vào mẫu.

Khử trùng hạt: Hạt dừa cạn được khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, javen 60% lắc đều trong 15 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Hạt dừa cạn sau khi khử trùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng MS cơ bản, bổ sung thêm sucrose 30 g/ l và agar 8 g/ l.

Môi trường tái sinh: Sau khi hạt nảy mầm được chuyển sang môi trường tái sinh cây là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/ l, agar 8 g/ l và BAP 0,5 mg/ l [2].

Các môi trường đều được chuẩn pH = 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng 30 – 40 Em-2s- 1, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ ngày.

2.3.2. Phương pháp chuyển gen vào cây dừa cạn

Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Bùi Thị Hà và cs (2016) [9]. Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm dựa theo các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào cây dừa cạn đã được tối ưu bao gồm: (i) Vật liệu chuyển gen là lá mầm; (ii) Nồng độ vi khuẩn OD600nm= 0,8; (iii) Nồng độ acetosyringone là 100µM; (iv) Thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút; (v) Nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen là 50 mg/ l. Quy trình chuyển gen Prx vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A.

Hình 2.1. Sơ đồ chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens

Chọn lọc chồi chuyển gen

Chọn lọc chồi trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l

Tái sinh chồi chuyển gen

Chồi sống sót được tái sinh trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l

Tạo cây hoàn chỉnh và ra cây

- Chồi tái sinh được chuyển sang môi trường ra rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l. - Đưa cây ra môi trường tự nhiên

Chuẩn bị vật liệu chuyển gen

- Gieo hạt tạo cây con in vitro - Thu lá mầm 10 – 14 ngày tuổi Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens với mật độ OD600nm = 0,8 Chuyển gen

- Lá mầm được nhiễm khuẩn trong thời gian 30 phút + AS 100 µM

- Đồng nuôi cấy 3 ngày trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 3,9g/ l + muối B5 0,3g/ l + AS 100µM

Bảng 2.1. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với Dừa cạn Loại môi trường Kí hiệu Thành phần Nảy mầm hạt (Germination medium) GM

MS cơ bản + sucrose 30 g/ l + agar 9 g/ l, pH = 5,8

Đồng nuôi cấy (Co-cultivation medium)

CCM

MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,39g/ l + muối B5 0,3g/ l + AS 100 µM Cảm ứng tạo đa chồi (Shoot induction medium) SIM

MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l

Kéo dài chồi (Shoot

elongation medium)

SEM

MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l Ra rễ (Rooting medium) RM

MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l

Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường Thành phần

LB lỏng Bacto pepton 10 g/ l + NaCl 10 g/ l + Yeast Extract 5 g/ l, pH = 7

2.3.1.1. Nguyên liệu biến nạp

Khử trùng hạt bằng cồn 70% lắc trong 1 phút. Sau đó ngâm hạt trong dung dịch nước tẩy (Javel 60%) lắc trong 15 phút. Loại bỏ dung dịch nước tẩy và rửa hạt bằng nước cất khử trùng. Hạt dừa cạn sau khi khử trùng cho nảy mầm trên môi trường MS cơ bản. Sau 10 – 14 ngày cây con phát triển, lá được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng, sử dụng làm nguyên liệu biến nạp gen và nuôi cấy in vitro.

2.3.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm

Cấy trải A. tumefaciens cất giữ trong glycerol lên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kanamycin 50 mg/ l và rifamicin 50 mg/ l, nuôi ở 28oC trong 48 - 96 giờ. Sau đó, lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin và nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở 28oC trong 16 – 18 giờ. Lấy 1ml dịch vi khuẩn nuôi hoạt hóa trong 10ml LB lỏng ở tốc độ 220 vòng/ phút ở 28oC trong 3 – 4 giờ. Lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy lần 2 ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút, ở 4oC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi trường 1/ 2 MS và pha loãng cho tới mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm = 0,8.

2.3.1.3. Lây nhiễm và đồng nuôi cấy

Các mảnh lá mầm dừa cạn được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 3 – 4 lần vào phần nách lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100µM, trong 30 phút sau đó thấm khô. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian 3 ngày.

2.3.1.4 . Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM

Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được rửa trong môi trường 1/ 2 MS có bổ sung cefotaxim 500 mg/ l với thời gian là 10 phút,

sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo cảm ứng đa chồi (SIM) có bổ sung kanamycin 50 mg/ l.

2.3.1.5. Kéo dài chồi

Sau 4 tuần, các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn lọc được loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM).

2.3.1.6. Tạo rễ

Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 2 – 3cm sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ (RM) để tạo cây hoàn chỉnh.

2.3.1.7. Cây ra môi trường tự nhiên

Cây con có chiều cao 8 – 10 cm và rễ đạt từ 5 – 7 cm được đưa ra giá thể, để nơi tránh ánh sáng trực tiếp. Sau 1 tuần có thể tưới cây bằng dung dịch MS với tỷ lệ 1/ 10, ngày 1 lần. Sau 2 đến 3 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra môi trường.

2.3.2. Phân tích cây chuyển gen

2.3.2.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR

Tách chiết DNA tổng số từ lá cây dừa cạn chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 35S để xác định sự có mặt của gen crPrx với thành phần ở bảng 2.5 theo chu trình nhiệt các bước ở bảng 2.6. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 0,8%.

Trình tự mồi 35S:

F: 5’ – CAA CGT CTT CAA AGC AAG TGG – 3’

R: 5’ – TTC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C – 3’

Phương pháp tách chiết DNA tổng số

- Cân 200 mg mẫu lá và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển vào ống E ppendorf 2 ml.

- Bổ sung 1 ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống Eppendorf 2 ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 12000 vòng/ phút (v/ p) trong 7 phút ở 4oC.

- Loại di ̣ch nổi và lă ̣p la ̣i bước 2 – 3 từ 1 đến 2 lần.

- Bổ sung 0,8 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phú t đến 1 tiếng.

- Giữ mẫu ở nhiệt đô ̣ phòng trong thời gian 10 phút.

- Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều trong thờ i gian 10 phút. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC.

- Hút dịch nổi cho vào ống Eppendorf 1,5 ml mới.

- Bổ sung mô ̣t thể tích tương đương isopropanol (la ̣nh), đảo nhẹ, để ở đá trong 30 phút. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC.

- Loại bỏ dịch nổi thu tủa, bổ sung 0,5 ml cồn 80%. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 4 phút ở 4oC (bướ c này thực hiê ̣n 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol.

- Làm khô DNA bằ ng quạt gió , máy hút chân không.

- Hòa tan DNA trong 100 µl nước khử ion. Bổ sung 3 µl RNase (10 mg/ ml) ủ ở 37oC trong 1 giờ.

Bảng 2.3 : Hóa chất pha đê ̣m rửa

STT Hó a chất Nồ ng độ stock

Nồ ng độ sử du ̣ng Thể tích

1 Tris- HCl pH 8 1 M 100 mM 5 ml

2 EDTA pH 8 0,5 M 5 mM 0,5 ml

3 Sorbitol Bột 0,35 M 3,1885 g

4 NaH2PO4 Bột 0,4% 0,5 g

Thêm nước đến thể tích cuối cùng là 50 ml 50 ml

Bảng 2.4: Hóa chất pha đê ̣m chiết

STT Hó a chất Nồ ng độ stock

Nồ ng độ sử dụng Thể tích 1 CTAB Bột 2% 0,5 g 2 NaCl 5 M 1,4 M 7 ml 3 EDTA pH 8 0,5 M 20 mM 1 ml 4 Tris- HCl pH 8 1 M 100 mM 2,5 ml 5 β -MercaptoEthanol 0,1% 25 µl

Thêm nước đến thể tích cuối cùng 25 ml 25 ml

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S

STT Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)

1 H2O - 10

2 Master mix 2X 12,5

3 Mồi xuôi 10 pmol/ µl 1

4 Mồi ngược 10 pmol/ µl 1

5 AND/ cDNA 100 ng/ µl 0,5

Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

1 Biến tính 94 5 phút

30

2 Biến tính 94 30 giây

3 Gắn mồi 56 30 giây

4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây

5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút

6 Kết thúc phản ứng 15 ∞

Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR

- Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45 – 50oC đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn. Sau 30 phú t khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5 – 1 cm.

- Tra mẫu: Sản phẩm PCR tra vào các giếng trên gel.

- Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn. Đặt 120V, 90mA, 30 phút.

- Nhuộm bản gel trong dung dịch ethibium trong 15 phú t.

- Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr.

- Chụp ảnh gel.

2.3.2.3. Các phương pháp phân tích xử lý số liệu

Hiệu suất chuyển gen được xác định bằng công thức: