Phòng thí nghiệm Hóa-Sinh thuộc Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng ở số 45 đường 3/2, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian: Từ ngày 1/8/2014 đến ngày 1/11/2014. Từ ngày 1/8/2014 đến ngày 1/11/2014. 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ Hệ thống phân tích HPLC-DAD Hình 3.1 Hệ thống HPLC Hệ thống phân tích ICP-OES Hình 3.2 Hệ thống ICP-OES Cân phân tích
Máy siêu âm hòa tan
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
25 Pipet, micropipet Ống đong Bình tam giác Ống ly tâm Phễu lọc Bộ lọc đường kính lỗ lọc 0,45 µm Bếp điện 3.1.4 Hóa chất
Dung dịch MeOH tinh khiết (Merck)
Dung dịch acid HNO3 (Merck)
Dung dịch acid HCl (Merck)
Dung dịch chuẩn Pb, Cd 1.000 ppm (Merck)
Chuẩn Caffeine tinh khiết 99% (Merck)
Nước cất 2 lần khử ion
3.2 Đối tượng nghiên cứu:
Tiến hành nghiên cứu các độc tố trên các mẫu cà phê rang, mẫu được thu lấy ở 3 điểm chợ trên địa bàn quận Ninh Kiều thành phố Cần Thơ, mỗi địa điểm tiến hành thu 5 mẫu. Các chợ được khảo sát là: chợ Xuân Khánh, chợ Hưng Lợi và chợ Trần Việt Châu.
Bảng 3.1 Địa điểm thu mẫu cà phê
Địa chỉ Số lượng
mẫu Ký hiệu Chợ Xuân Khánh đường 30/4, phường Xuân Khánh,
quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ 5
Từ mẫu 1 đến mẫu 5 Chợ Hưng Lợi quốc lộ 91B, phường Hưng Lợi quận
Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ 5
Từ mẫu 6 đến mẫu 10 Chợ Trần Việt Châu đường Nguyễn Văn Cừ, quận Ninh
Kiều, thành phố Cần Thơ 5
Từ mẫu 11 đến mẫu 15
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
26
3.3 Phương pháp nghiên cứu
Từ các phương pháp khảo sát một số độc tố trong cà phê đã trình bày ở phần tổng quan, lựa chọn phương pháp tốt nhất để tiến hành thí nghiệm xác định hàm lượng caffeine, Pb, Cd.
3.4 Hoạch định thí nghiệm
Thẩm định phương pháp HPLC xác định hàm lượng caffeine
Độ lặp lại của phương pháp
Hiệu suất thu hồi
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Khoảng tuyến tính
Xác định hàm lượng caffeine
Xác định hàm lượng kim loại Pb, Cd bằng phương pháp ICP-OES và tính toán hiệu suất thu hồi của phương pháp
3.5 Thực nghiệm
3.5.1 Thẩm định phương pháp HPLC[5] và xác định hàm lượng caffeine
3.5.1.1 Độ lặp lại a Định nghĩa
Độ lặp lại của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thí nghiệm khi phương pháp thử được áp dụng nhiều lần trên cùng một mẫu. Đặc trưng của độ lặp lại là độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD.
b Tiến hành
Tiến hành xác định độ lặp lại của phương pháp trên cùng một mẫu cà phê. Mẫu được xử lý và được tiêm vào máy để phân tích, quá trình thực hiện với 5 lần lặp lại và tính độ lệch chuẩn tương đối RSD, giá trị RSD yêu cầu là ≤ 2%.
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
27
c Tính toán kết quả
Kết quả khảo sát độ lặp lại được tính toán theo công thức: Độ lệch chuẩn SD
Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)
Trong đó:
xi: giá trị đo thứ i
X: giá trị trung bình n: số lần đo
3.5.1.2 Hiệu suất thu hồi a Định nghĩa
Hiệu suất thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực của mẫu. Giá trị thực của mẫu không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu chấp nhận được gọi là giá trị đúng.
b Tiến hành
Thêm dung dịch chuẩn caffeine ở ba điểm nồng độ 0,5; 4 và 10 ppm vào mẫu cà phê, tiến hành định lượng và tìm lại hàm lượng chất chuẩn đã thêm vào để tính toán hiệu suất thu hồi. Nếu hàm lượng caffeine ≥ 0,01 ppm thì hiệu suất thu hồi yêu cầu phải đạt từ 80-110%.
Bảng 3.2 Khoảng nồng độ và hiệu suất thu hồi được chấp nhận theo 2002/657/EC Nồng độ (ppm) Kết quả chấp nhận được ≤ 0,001 50-120% > 0,001 đến < 0,01 70-110% ≥ 0,01 80-110% 1 n ) X x ( SD 2 i 100 X SD CV RSD
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
28
c Tính toán kết quả
Công thức tính hiệu suất thu hồi H%
100 S S 100 S S S % H đo ) đo ( c đo m c m ' Trong đó:
H%: là hiệu suất thu hồi (%)
Sm+c : là diện tích đỉnh của mẫu được thêm chuẩn (đvdt) Sm: là diện tích đỉnh của mẫu (đvdt)
Sc(đo): là diện tích đỉnh của dung dịch chuẩn được thu hồi (đvdt) Sđo: là diện tích đỉnh của các dung dịch chuẩn đo được (đvdt)
3.5.1.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng a Định nghĩa
Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được được nhưng chưa thể định lượng được.
Giới hạn định lượng là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
b Tiến hành
Xác định LOD được tiến hành trên mẫu thử (mẫu thử có nền mẫu tương tự với mẫu thật nhưng không có chất phân tích), mẫu thử được thêm chuẩn caffeine ở nồng độ 0,5 ppm và định lượng để tìm tỷ lệ S/N và tính toán giá trị LOD, quá trình trên được lặp lại 5 lần.
Xác định LOQ: giá trị LOQ được tính toán dựa trên giá trị LOD.
Tỷ lệ S/N là tỷ lệ giữa chiều cao tín hiệu chất cần phân tích và nhiễu nền, tỷ lệ S/N được tính như sau:
Trong đó:
H: chiều cao tín hiệu h: chiều cao của nhiễu
h H 2 N / S
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
29
Hình 3.3 Sơ đồ minh họa tỷ lệ S/N
c Tính toán kết quả
Công thức tính toán
Giới hạn phát hiện: LOD (ppm)
m ) N / S ( C 3 LOD
Giới hạn định lượng : LOQ (ppm)
LOD 3 LOQ Trong đó: C: nồng độ chất phân tích có mẫu (ppm) Vđm: thể tích định mức (mL)
S/N : tỷ lệ tín hiệu chiều cao chất phân tích trên đường nền m: khối lượng mẫu phân tích (g), m = 0,25 g
3.5.1.4 Khoảng tuyến tính a Định nghĩa
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ mà trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích
b Tiến hành
Pha một dãy dung dịch caffeine chuẩn có nồng độ lần lượt là 0,5; 2; 4; 6; 8 và 10 ppm. Bơm vào máy các dung dịch chuẩn trên và ghi nhận diện tích đỉnh tương ứng.
H
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
30
Từ kết quả thu được, dùng phần mềm tính toán Excel tính toán phương trình biểu diễn sự phụ thuộc hàm lượng caffeine theo diện tích đỉnh.Từ đó tính được hệ số tương quan R2, thông số R2 thuộc khoảng 0,99 ≤ R2 ≤ 1 thì đảm bảo yêu cầu về tính tuyến tính.
c Tính toán kết quả
Công thức tính hệ số tương quan R2
Trong đó:
R2: hệ số tương quan
xi: giá trị thứ i của nồng độ caffeine chuẩn.
X: giá trị trung bình của nồng độ caffeine chuẩn yi: giá trị thứ i của diện tích đỉnh caffeine chuẩn
Y: giá trị trung bình của diện tích đỉnh
3.5.1.5 Xác định hàm lượng caffein a Thiết bị và dụng cụ và hóa chất Hệ thống HPLC, đầu dò DAD Micropipet loại 10 µL và 100 µL Bộ lọc với đường kính lỗ lọc là 0,45 µm Ống ly tâm 15 mL có nắp vặn Pipet 10 ml
Chuẩn caffeine tinh khiết 99%
Dung dịch MeOH tinh khiết
Nước cất 2 lần khử ion
b Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Chuẩn bị dung dịch chuẩn caffeine 1.000 ppm: cân 3,6 mg chuẩn caffeine tinh khiết và thêm 3,6 mL nước cất 2 lần khử ion, sau đó đánh siêu hoà tan hoàn toàn.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 50 ppm: hút 50 µL dung dịch chuẩn caffeine vào vial 1 mL, thêm nước cất và lắc đều.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc: từ dung dịch chuẩn trung gian chuẩn bị các dung dịch làm viêc có nồng độ lần lượt 0,5; 2; 4; 6;8 và 10 ppm.
2 i 2 i i i 2 Y y X x Y y X x R
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
31
c Chuẩn bị mẫu
Cân 0,25 g cà phê cho vào ống ly tâm 15 mL, thêm 10 mL nước, đánh siêu âm hoà tan khoảng 30 phút, nhiệt độ trong bể siêu âm khoảng 80 0C.
Dung dịch sau khi chiết được lọc qua bộ lọc có đường kính lỗ 0,45 µm. Pha loãng dung dịch sau khi lọc: hút 10 µl dung dịch cho vào vial 1 mL, thêm nước cất và lắc đều.
d Điều kiện phân tích
Bước sóng: 273 nm
Cột sắc ký: RP -18 (150 x 4,6 mm x 5 µm)
Dung môi pha động: hỗn hợp MeOH/H2O (tỷ lệ 65:35)
Nhiệt độ cột: 20 0C
Tốc độ dòng: 0,6 mL/phút
Thể tích bơm: 10 µL
Thời gian lưu: 5,3 đến 5,7 phút
Thời gian phân tích mỗi mẫu: 8 phút
e Tiến hành thí nghiệm
Các dung dịch chuẩn làm việc, các dung dịch mẫu được tiêm vào hệ thống phân tích HPLC bằng bộ tiêm tự động autosampler, thiết lập điều kiện phân tích và tiến hành định lượng.
f Tính toán kết quả
Công thức tính toán
Dựa vào sắc ký đồ hàm lượng caffeine trong cà phê được tính theo công thức sau: a m V C ' C đm Trong đó:
C’: nồng độ caffeine có trong mẫu cà phê (ppm) C :hàm lượng caffeine tính từ đường chuẩn (ppm) Vđm: thể tích định mức (mL), Vđm = 10 mL
m: khối lượng mẫu cà phê (g) a: hệ số pha loãng, a = 100
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
32
3.5.2 Xác định hàm lượng Pb, Cd bằng phương pháp ICP-OES (phương pháp 2) (phương pháp 2)
3.5.2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Hệ thống máy ICP – OES
Cân phân tích
Bếp điện
Pipet
Bình định mức
Dung dịch chuẩn Pb, Cd 1.000 ppm (Merck)
Dung dịch HCl, HNO3 (Merck)
Nước cất 2 lần khử ion
3.5.2.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn Pb, Cd trung gian: từ dung dịch chuẩn Pb và Cd 1.000 ppm pha các dung dịch trung gian có nồng độ 50 ppm, 5 ppm.
Xây dựng các dung dịch chuẩn làm việc: các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0; 0,1; 0,3; 0,5; 1 ppm từ dung dịch chuẩn 5 ppm.
3.5.2.3 Chuẩn bị mẫu
Cân khoảng 2 g mẫu cho vào cốc thủy tinh, thêm 20 mL hỗn hợp acid mạnh HCl : HNO3 (3:1) ngâm trong qua đêm.
Đun hỗn hợp trên bếp điện khoảng 30 phút để đuổi hết acid.
Dịch chiết được chuyển bình định mức 100 mL và lọc sạch và phân tích bằng hệ thống ICP-OES.
Thực hiện quá trình trên đối với mẫu có thêm chuẩn 0,1 ppm để xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp.
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
33
3.5.2.4 Điều kiện phân tích
Tốc độ bơm: 45 rpm (round per minute-vòng trên phút)
Công suất nguồn RF (nguồn phát bức xạ radio): 1100 W
Đường kính ống: 2 mm
Định hướng Torch: Axial
Tốc độ hơi plasma: 12 L/phút
Tốc độ dòng hơi Argon: 0,6 L/phút hoặc 0,22 MPa
Tốc độ hơi phụ trợ: 0,5 L/phút
Thời gian thổi mẫu: 45 giây
Chế độ buồng phun hơi (spray): xoáy
Thời gian chạy giữa các mẫu: 10 giây
3.5.2.5 Tiến hành thí nghiệm
Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc, các dung dịch mẫu đã chuẩn bị vào hệ thống ICP-OES để định lượng và tính toán hiệu suất thu hồi của phương pháp.
3.5.2.6 Tính toán kết quả
Công thức tính toán
Hiệu suất thu hồi của phương pháp được tính theo công thức:
100 C C 100 C C C % H đo ) đo ( c đo c m
Hàm lượng Pb và Cd trong mẫu được tính theo công thức:
a m V C ' C đm Trong đó:
H%: hiệu suất thu hồi của phương pháp (%)
Cm+c: hàm lượng Pb (hoặc Cd) trong mẫu được thêm chuẩn (ppm) C: giá trị hàm lượng Pb (hoặc Cd) tính từ đường chuẩn (ppm)
Cc(đo): hàm lượng trung bình của chuẩn Pb ( hoặc Cd) được thu hồi (ppm) Cđo: là hàm lượng Pb (hoặc Cd) trong chuẩn 0,1 ppm đo được (ppm) C’: hàm lượng Pb (hoặc Cd) trong mẫu cà phê (ppm)
Vđm: thể tích định mức (mL), Vđm = 100 mL m: khối lượng mẫu cà phê (g)
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
34 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ 4.1 Thẩm định phương pháp HPLC và xác định hàm lượng caffeine 4.1.1 Thẩm định phương pháp 4.1.1.1 Độ lặp lại
Kết quả khảo sát độ lặp của phương pháp được trình bày ở bảng sau Bảng 4.1 Kết quả khảo sát độ lặp lại
Số lần đo Thời gian lưu (phút) Diện tích đỉnh (đvdt)
1 5,588 69,547 2 5,542 68,723 3 5,541 69,011 4 5,550 68,556 5 5,513 69,253 Trung bình 5,547 69,014 SD 0,027 0,396 RSD (%) 0,487 0,574 Nhận xét:
Phương pháp có độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,574% (< 2%), như vậy độ lặp lại của phương pháp ổn định.
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
35
4.1.1.2 Hiệu suất thu hồi
Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi được trình dưới đây.
Điểm chuẩn 0,5 ppm:
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi tại điểm chuẩn 0,5 ppm Sm+c (ppm) Sm (ppm) Sc(đo) (ppm) Sđo (ppm) H% (%) RSD (%) 83,003 69,547 13,763 14,754 93,283 1,671 82,342 68,723 83,012 69,011 82,554 68,556 82,977 69,253 Nhận xét:
Hiệu suất thu hồi ở điểm nồng độ 0,5 ppm là 93,283% đã đạt yêu cầu.
Điểm chuẩn 4 ppm
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi tại điểm chuẩn 4 ppm Sm+c (ppm) Sm (ppm) Sc(đo) ppm) Sđo (ppm) H% (%) RSD (%) 180,456 69,547 111,666 118,102 94,550 0,630 181,057 68,723 180,328 69,011 181,005 68,556 180,555 69,253 Nhận xét:
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
36
Điểm chuẩn 10 ppm
Bảng 4.4 Kết quả sát hiệu suất thu hồi tại điểm chuẩn 10 ppm Sm+c (ppm) Sm (ppm) Sc(đo) ppm) Sđo (ppm) H% (%) RSD (%) 351,231 69,547 282,825 300,411 94,149 0,250 351,987 68,723 352,510 69,011 351,875 68,556 351,596 69,253 Nhận xét:
Hiệu suất thu hồi ở điểm nồng độ 10 ppm là 94,146% đã đạt yêu cầu.
Kết luận:
Hiệu suất thu hồi được khảo sát ở 3 điểm nồng độ 0,5; 4; 10 ppm đều đạt hiệu suất cao trên 90% so với yêu cầu. Vậy phương pháp khảo sát có hiệu suất thu hồi cao.
4.1.1.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Kết quả khảo sát LOD và LOQ được trình bày dới đây Bảng 4.5 Kết quả khảo sát LOD và LOQ STT C (ppm) S/N LOD LODtb LOQ 1 0,5 65,411 0,092 0,093 0,279 2 0,5 63,959 0,094 3 0,5 64,025 0,090 4 0,5 63,761 0,094 5 0,5 63,815 0,094 Nhận xét:
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp thấp: LOD = 0,093 ppm (< 0,1 ppm) và LOQ = 0,279 ppm.
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
37
4.1.1.4 Khoảng tuyến tính
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được được trình bày dưới đây. Bảng 4.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Nồng độ C (ppm) Thời gian lưu Diện tích đỉnh (đvdt)
0,5 5,693 14,754 2 5,612 58,231 4 5,723 118,102 6 5,623 176,003 8 5,604 235,780 10 5,568 300,411
Đồ thị minh họa minh họa tính tuyến tính của phương pháp
Hình 4.1Đồ thị minh họa tính tuyến tính của phương pháp