Caffeine là một alkaloid chứa gốc xanthine có công thức phân tử là C8H10N4O2. Tên gọi khoa học: 3,7-dihydro-1,3,7-trimethyl-1H-purine-2,6- dione và một số tên gọi khác như trimethylxanthyl, guaranine, theine,... Caffeine tinh khiết ở dạng tinh thể, màu trắng và vị đắng.
N N Me C O- O C O OH
Trigonelline Nicotinic acid
Phản ứng chuyển hóa trigonelline thành nicotinic acid
Phản ứng hình thành chlorogenic acid lactone và quinic acid lactone từ chlorogenic acid
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
13 Công thức hóa học của caffeine
Caffeine tồn tại ở dạng tự nhiên trong hơn 60 loài thực vật bao gồm hạt cà phê, lá trà, quả ca cao, hạt kola,... Quá trình tách chiết caffeine xảy ra dưới áp suất cao kết hợp với khí CO2. Người ta thường thêm caffeine vào thức ăn, nước uống và dược phẩm do một số dược tính có lợi. Caffeine có tác dụng kích thích sự trao đổi chất và hoạt động của hệ thần kinh trung ương, làm giảm sự mệt mỏi thể chất, phục hồi sự tập trung tỉnh táo trong khi cơ thể ở tình trạng uể oải. Ngoài ra, nó có thể giúp giảm đau, giảm nguy cơ mắc bệnh hen suyễn và chữa dị ứng. Chính vì vậy, caffeine trở thành chất kích thích được sử dụng phổ biến trên thế giới. Đối với nhiều người, đặc biệt là những nhân viên văn phòng, họ có thói quen thưởng thức cà phê vào mỗi buổi sáng hay trong giờ giải lao để tinh thần thoải mái và tỉnh táo hơn. Tuy nhiên việc lạm dụng caffeine đã gây ra những tác hại to lớn đến sức khoẻ.
Nếu một người sử dụng 600 mg caffeine hoặc nhiều hơn mỗi ngày có thể gây khó ngủ, nhức đầu, đau cơ và mất nước. Caffeine tác động lên hệ thần kinh trung ương tăng cường sản sinh nhiều adenosine kích thích hoạt động ngay cả khi cơ thể cần được nghĩ ngơi. Vì vậy, thời gian sử dụng caffeine lâu dài sẽ tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch, giảm sút trí nhớ. Bên cạnh đó, nó có thể gây tổn thương tuyến thượng thận, phụ nữ mang thai sinh con nhẹ cân hoặc bị sảy thai.
Theo khuyến cáo của Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ (FAD) hàm lượng caffeine tối đa được sử dụng mỗi ngày là:
Đối với người trưởng thành: ≤ 400 mg/ngày, tương đương 6 mg/1 kg cân nặng đối với người 65 kg.
Đối với phụ nữ ở độ tuổi sinh sản: ≤ 300 mg/ngày, tương đương 4,6 mg/1 kg cân nặng đối với người 65 kg.
Đối với trẻ em: hàm lượng caffeine ≤ 2,5 mg/1 kg cân nặng/1 ngày. Công thức hóa học của caffeine
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
14
2.2.2 Kim loại Pb[11],[13],[14]
Chì (tên tiếng Latin là Plumbum) là một nguyên tố hoá học trong bảng hệ thống tuần hoàn, kí hiệu là Pb. Pb có trong vỏ trái đất, nó không tồn tại tự do mà liên kết với một hay nhiều nguyên tố khác hình thành hợp chất Pb. Pb tinh khiết là một kim loại mềm, dễ uốn, màu xám. Trong môi trường nó tồn tại dưới dạng ion Pb2+ trong các hợp chất hữu cơ và vô cơ như PbS, PbCO3, [Pb(CH3COO)2.3H2O], [Pb(C17H35COO)2],…
Pb được sử dụng rất phổ biến, theo thống kê cho thấy có 150 nghề và hơn 400 quá trình công nghệ khác đều sử dụng Pb như:
Trong công nghiệp kĩ thuật điện: pin, vỏ bọc dây cáp, làm que hàn,…
Trong công nghiệp hoá chất: mạ Pb lên bề mặt bên trong các buồng và tháp sản xuất sunfuric acid, các bể tẩy rửa, các bể điện phân.
Trong các ngành công nghiệp khác: làm tấm chắc bức xạ, các chất nhuộm màu, sơn, làm đầu đạn…
Hiện tượng ô nhiễm Pb ngày càng phổ biến nhất là ở các nước phát triển ngành khai thác và chế tạo hợp kim của Pb. Nó xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua 2 con đường:
Qua hô hấp: hít khói xả từ các động cơ đốt trong bằng xăng dầu, hàn Pb, bụi sơn từ các nhà cao tầng.
Qua đường tiêu hoá: sử dụng chén, đĩa có sơn màu loè loẹt, thực phẩm bị phơi nhiễm Pb trong sản xuất và chế biến, nguồn nước sinh hoạt,…
Pb xâm nhập vào cơ thể người và gây những ảnh hưởng xấu đến sức khỏe. Việc tiếp xúc với Pb trong thời gian dài tại nơi làm việc làm suy giảm chức năng của hệ thần kinh, sự yếu kém hoạt động của ngón tay, cổ tay, mắc cá chân. Qua hệ tiêu hoá, Pb tích tụ và làm tổn thương thận, tăng huyết áp,
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
15
thiếu máu đặc biệt là đối với người trung niên và người cao tuổi. Nếu ở mức độ phơi nhiễm cao có thể tử vong.
Theo quy chuẩn Việt Nam (QCVN 8-2:2011/BYT) cho phép mức độ ô nhiễm của Pb trong cà phê là 2 ppm.
2.2.3 Kim loại Cd[11],[12],[13],[14]
Cadimi (tên tiếng Latin là Cadmium) là nguyên tố hóa học trong bảng hệ thống tuần hoàn, kí hiệu là Cd. Cd có trong vỏ trái đất và thường nằm tập trung trong một số quặng kim loại như Cu, Zn, Pb,... Cd tinh khiết mềm, dẻo và màu trắng xanh. CdCl2 và CdSO4 là hai dạng tồn tại phổ biến của Cd trong nước.
Phần lớn Cd được thu hồi từ quá trình tinh chế một số kim loại như Cu, Zn, Pb và một phần từ pin đã sử dụng. Ngày nay, Cd được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như:
Trong ngành chế tạo pin: 83% Cd được dùng chế tạo pin, chủ yếu là loại pin Ni-Cd có thể sạc lại.
Trong ngành mạ điện: công nghiệp mạ điện Cd được dùng chủ yếu trong chế tạo máy bay, lớp mạ Cd bền bảo vệ các phụ kiện bằng thép không bị ăn mòn.
Trong ngành phân hạch hạt nhân: Cd là tế bào quang điện kiểm soát notron trong phản ứng phân hạch hạt nhân.
Trong ngành luyện kim: dùng trong ngành công nghiệp luyện kim màu. Cd được phát tán vào môi trường thông qua hoạt động khai thác khoáng sản và tinh chế kim loại màu, các hoạt động sản xuất và sử dụng phân bón phosphate, quá trình đốt cháy nhiên liệu hóa thạch hay thiêu đốt và xử lý chất thải. Hút thuốc cũng là hoạt động quan trọng để phát tán Cd, những người hút thuốc có nguy cơ phơi nhiễm Cd gấp hai lần so với người không hút thuốc.
Qua quá trình hô hấp và tiêu hoá Cd xâm nhập vào cơ thể, nó gây ra tác hại to lớn đến sức khoẻ. Theo kết quả nghiên cứu của một nhóm các nhà khoa
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
16
học tại phòng thí nghiệm Argonne thuộc Bộ năng lượng Mỹ, cho thấy Cd giải phóng Ca khỏi xương sau vài giờ phơi nhiễm ngay cả ở mức thấp, đó là nguyên nhân gây bệnh xương thuỷ tinh. Bên cạnh đó, Cd có thể gây tổn thương thận, ung thư vú, ung thư phổi và thậm chí là tử vong nếu bị ngộ độc ở mức cao.
Theo quy chuẩn QCVN 8-2:2011/BYT cho phép mức độ ô nhiễm Cd trong cà phê là 1 ppm.
2.3 Các phương pháp xác định độc tố 2.3.1 Phương pháp xác định caffeine 2.3.1.1 Phương pháp 1 (UV-Vis)[10] a Nguyên tắc
Caffeine được chiết bằng nước ấm, sau đó dịch chiết được tiến hành chiết lỏng-lỏng với dichoromethane và so màu bằng máy quang phổ tử ngoại- khả kiến (UV-vis) ở bước sóng 274,7 nm. Dùng chuẩn Gaussian để loại bỏ nhiễu nền trên phổ đồ ở vùng 308-310 nm.
b Tiến hành
Cân 50 mg cà phê, thêm vào 25 mL nước. Sau khi đánh siêu ấm có gia nhiệt khoảng 60 0C trong 1 giờ, dung dịch được lọc sạch phần rắn và tiến hành chiết lỏng-lỏng với dicloromethan. Quá trình chiết lặp lại 4 lần, mỗi lần chiết sử dụng 25 mL dicloromethan. Trong lần chiết thứ nhất dịch chiết được đánh siêu âm khoảng 10 phút. Sau đó lọc sạch và giữ trong bình định mức 100 mL. Tiến hành so màu bằng máy quang phổ UV-Vis ở bước sóng 274,7 nm.
c Tính toán kết quả
Dùng chuẩn Gaussian loại bỏ nhiễu nền bị ảnh hưởng ở vùng bước sóng từ 308-310 nm, dùng phương trình Lambert’s-Beer để tính hàm lượng caffeine:
Trong đó:
A : mật độ quang
ε : hệ số hấp thụ mol phân tử của caffeine trong dichloromethane C: là hàm luợng caffeine (M, ppm)
: chiều dày cuvet (cm)
C . . A
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
17
2.3.1.2 Phương pháp 2 (HPLC-DAD) a Nguyên tắc
Chiết caffeine trong cà phê bằng nước ấm (60-80 0C), sau đó dịch chiết được lọc sạch và tiến hành phân tích bằng hệ thống HPLC trên cột RP-18, rửa giải đẳng dòng bằng đầu dò DAD với bước sóng 273 nm.
b Tiến hành
Cân khoảng 0,1-1 g cà phê vào ống ly tâm, thêm 10 ml nước, sau đó đánh siêu âm có gia nhiệt ở 80 0C trong 30 phút. Dịch chiết được lọc sạch và tiến hành định lượng bằng HPLC.
c Tính toán kết quả
Hàm lượng caffeine được xác định bằng công thức:
Trong đó:
C’: nồng độ caffeine có trong cà phê (ppm)
C: hàm lượng caffeine tính từ đường chuẩn (ppm) Vđm: thể tích định mức (mL)
m: khối lượng mẫu cà phê (g) a: hệ số pha loãng (nếu có)
2.3.2 Phương pháp xác định Pb, Cd 2.3.2.1 Phương pháp 1[8],[9]
a Nguyên tắc
Dung dịch N-ethyl-3-carbazolecarbaxaldehyde-3-thiosemicarbazone (ECCT) phản ứng với Cd (II) và Pb (II) tạo phức màu vàng hoặc đỏ cam trong dung dịch đệm acetate phosphate (pH = 6) được so màu bằng máy quang phổ UV-vis ở bước sóng lần lượt 380 và 440 nm.
b Tiến hành
Chuẩn bị thuốc thử ECCT: 0,5 g N-ethylcarbazolecarbaxaldehyde (ECC) được hòa tan trong 25 mL ethanol và cho vào bình chứa. Sau đó cho thêm vào bình chứa đó hỗn hợp của 1,5 g thiosemicarbazone được hòa tan trong 25 mL ethanol:nước (1:1). Lắc đều hỗn hợp và làm nguội dưới vòi nước
a m V C ' C đm
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
18
khoảng 2 giờ đến khi thu được chất rắn màu vàng. Dùng ethanol chiết ECCT và kết tinh ECCT.
Chuẩn bị mẫu: Cân 5 g mẫu và tro hóa ở 550 0C khoảng 4 giờ, sau đó hòa tan tro bằng 5 mL dung dịch HCl 2 mol.L-1 và đun sôi nhẹ. Lọc sạch hỗn hợp và định mức vào bình định mức 25 mL.
Dung dịch mẫu sau khi chiết được cho thêm dung dịch đệm acetate (pH = 6) và 1 mL thuốc thử ECCT (0,0015 mol.L-1). Hỗn hợp được lắc 2 lần với dầu hoả, mỗi lần 5 mL trong thời gian 1 phút. Sau đó lưu giữ hỗn hợp trong bình định mức 25 mL và định mức bằng dầu hoả. Tiến hành đo màu ở bước sóng 380 nm (Cd) và 440 nm (Pb).
c Tính toán kết quả
Áp dụng định luật Lambert’s – Beer để tính toán hàm lượng Pb và Cd
Trong đó:
A : mật độ quang
ε : hệ số hấp thụ mol phân tử C: là hàm luợng caffeine (M, ppm)
: chiều dày cuvet (cm)
2.3.2.2 Phương pháp 2[1],[3],[4] a Nguyên tắc
Dưới tác dụng của hỗn hợp acid mạnh HCl:HNO3 (3:1), kim loại Pb và Cd được chiết dưới dạng các ion hay nguyên tử. Sau đó tiến hành đo độ phát xạ của các ion hay nguyên tử này lần lượt ở bước sóng 203,5 nm (Pb) và 228,8 nm (Cd) bằng hệ thống ICP-OES. Kết quả được xử lý bằng hệ thống máy tính.
b Tiến hành
Cân khoảng 2 g cà phê, ngâm mẫu qua đêm với hỗn hợp acid HCl:HNO3 (3:1). Đun sôi hỗn hợp trên bếp điện khoảng 30 phút, lọc sạch dung dịch và tiến hành phân tích bằng hệ thống ICP-OES.
c Tính toán kết quả
Hàm lượng Pb và Cd trong cà phê dược tính theo công thức:
a m V C ' C đm C . . A
Luận văn tốt nghiệp đại học Huỳnh Thị Cẩm Giang – MSSV: 2111913 Ngành: Hóa phân tích – Khóa: 37
19 Trong đó:
C’: hàm lượng Pb và Cd có trong mẫu (ppm)
C:hàm lượng Pb và Cd phân tích được bằng (ppm) Vđm: thể tích định mức (mL)
m: khối lượng mẫu cà phê (g) a: hệ số pha loãng (nếu có)
2.4 Giới thiệu sơ lược về thiết bị sử dụng 2.4.1 Hệ thống HPLC