Sau khi tiến hành chuẩn hóa một số thành phần hóa chất và điều kiện phản ứng thì thành phần hóa chất và điều kiện phản ứng của qui trình PCR genotyping (ORF75) được chọn để ứng dụng trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú như sau:
M 1 2 3
Bảng 4.2 : Thành phần hóa chất được sử dụng đểứng dụng
Thành phần hóa chất được sử dụng để ứng dụng chỉ khác với qui trình ban đầu ở
lượng ADN chiết tách. Còn các thành phần hóa chất khác và tổng thể tích phản
ứng không thay đổi so với qui trình ban đầu.
Điều kiện phản ứng thì thay đổi khác so với qui trình ban đầu. Điều kiện phản
ứng được thực hiện với điều kiện là: máy được làm nóng đến 85oC. Sau đó đến giai đoạn 94oC trong 3 phút, 94oC trong 30 giây, 49oC trong 30 giây, 72oC trong 60 giây lặp lại 30 chu kỳ và cuối cùng là 72oC trong 7 phút.
Hóa chất Nồng độ Thể tích 1 mẫu
PCR bufer 1X 5 µl
MgCl2 1,5 mM 1,5 µl
dNTPs 200 µM 0,5 µl
ORF75- Flank Forward 20pmol 1 µl ORF75- Flank Reverse 20 pmol 1 µl Taq ADN polymerase 2,0U 0,4 µl
Nước 14,6 µl
ADN chiết tách 1 µl
Qui trình trên được chạy ứng dụng với 8 mẫu có cường độ nhiễm khác nhau (được kiểm tra là dương tính bằng bộ kit IQ2000-WSSV) nhằm kiểm tra tính ứng dụng của qui trình sau khi tối ưu. Và kết quả như sau:
Hình 4.8: Kết quảứng dụng 8 mẫu nhiễm WSSV thu ở Cà Mau Giếng M Thang ADN 100bp Giếng 6 Mẫu M8 Giếng 1 Mẫu N4 Giếng 7 Mẫu M10 Giếng 2 Mẫu W1 Giếng 8 Mẫu M11 Giếng 3 Mẫu W4 Giếng 9 Đối chứng âm Giếng 4 Mẫu W5 Giếng 10 Đối chứng dương Giếng 5 Mẫu M9
Từ kết quả trên cho thấy các mẫu có kích thước sản phẩm khác nhau. Qua các mẫu khảo sát (hình 4.8) thì kích thước sản phẩm có 4 dạng, các dạng kích thước sản phẩm được xác định nằm trong các khoảng là: 400-500bp (giếng 1, 2, 3, 4), 600-700bp (giếng 10), 800-900bp (giếng 5), 900-1000bp (giếng 6, 7, 8). Vì vùng lặp lại thuộc ORF75 có 2 loại trình tự lặp lại là 45bp, 102bp cho nên không thể
dùng công thức để xác định chính xác số lần lặp lại của các trình tự giống như
ORF94 và ORF125. Nên chỉ xác định được các dạng của sản phẩm. Nếu muốn xác định chính xác số lần lặp lại của vùng ORF75 thì phải giải mã trình tự của nó. Do điều kiện không cho phép nên đề tài chỉ thực hiện đến đây.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CHƯƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT