Xác định nhiệt độ gắn của mồi cũng có vai trò rất quan trọng trong phản ứng PCR. Nếu sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào ADN mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Theo Bui Thi Minh Dieu et al (2004) thì nhiệt độ gắn mồi được sử dụng trong phản ứng là 49oC. Vì vậy tiến hành dò tìm nhiệt độ mồi từ 49 đến 65oC (các điểm nhiệt độ dò tìm là 49oC; 51,1oC, 53oC; 55,7oC; 59,5oC; 62,3oC; 64oC; 65oC) để chọn nhiệt độ gắn mồi tối
ưu nhất.
Hình 4.3: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau
Giếng 1: nhiệt độ gắn mồi 65oC Giếng 6: nhiệt độ gắn mồi 53oC Giếng 2: nhiệt độ gắn mồi 64oC Giếng 7: nhiệt độ gắn mồi 51,1oC Giếng 3: nhiệt độ gắn mồi 62,3oC Giếng 8: nhiệt độ gắn mồi 49oC Giếng 4: nhiệt độ gắn mồi 59,5oC Giếng M: thang ADN 100 bp Giếng 5: nhiệt độ gắn mồi 55,7oC
Kết quả dò tìm nhiệt độ cho thấy ở nhiệt độ 65oC; 64oC; 62,3oC; 59,5oC; 55,7oC không ra kết quả. Có thể do nhiệt độ gắn mồi này cao hơn nhiệt độ gắn của mồi xuôi và mồi ngược nên mồi không thể gắn được vào ADN khuôn. Còn ở nhiệt độ
49oC; 51,1oC, 53oC thì cho kết quả. Độ sáng của các vạch ở nhiệt độ 51,1oC, 53oC
1 2 3 4 5 6 7 8 M
thì tương đương như nhau. Ở nhiệt độ 49 oC thì kết quả tốt hơn ở nhiệt độ 51,1oC, 53oC. Vì vậy, nhiệt độ gắn mồi vẫn được giữ là 49oC theo như Bui Thi Minh Dieu
et al ( 2004). Do đó tiếp tục tìm phương pháp khác để có thể phát hiện mẫu có cường độ nhiễm nhẹ.